克服强样品溶剂效应，实现液相色谱可持续性稳定分析
时间：2024-11-20 阅读：49
近日，陶氏化学与安捷伦基于 1290 UHPLC 系统合作开发了一种溶于二氯甲烷（DCM）中且浓度低至 ppb 级别的双酚 A 及其二缩水甘油醚衍生物混合物检测方法，该套设备采用了具有 feed 进样模式的 hybrid multisampler，在该进样模式下，样品以一定的进样速度注入流动相中，因此暂时稀释样品，克服了溶剂效应，同时进样量可高达 45 μL，这种新的进样方法显著提高了目标物质的检测限（>20×）。
消费后再生材料（PCR）在消费品中的使用正在增长，而 PCR 必须满足金属和有机成分的法规要求，或通过与应用相关的产品安全风险评估。有机成分通常包括专门添加的提高产品性能的物质（如抗氧化剂）和非添加的物质（NIAS），其中非添加物质（NIAS）包括了不同来源的几类有机物质，如污染物和降解物，可能对人体有害。
针对高分子量、非挥发性或者热不稳定的 NIAS，通常使用强溶剂（如二氯甲烷（DCM））提取树脂，然后使用反相液相色谱（RPLC）分析。强有机溶剂在提取塑料材料中 NIAS 时最具效力，但它们通常对 RPLC 的应用具有挑战性。因为 NIAS 的组成可能会因塑料类型和 PCR 的来源而有很大差异，为了在 PCR 非靶向分析中涵盖极性、疏水性和官能团方面的广泛有机分子，通常采用 C8 或 C18 作为固定相，流动相会从高比例水起始，到高比例有机改性剂（如乙腈或甲醇）结束来实现梯度洗脱，而当样品的溶剂（如二氯甲烷）洗脱强度远大于初始流动相组成的溶剂洗脱强度时，会对峰宽和峰形产生不利影响，尤其是对于早洗脱峰而言。
本文选择 DCM 制备的浓度为 10 ppm 的双酚 A（BPA）和 6 种双酚 A 二缩水甘油醚（BADGE）衍生物的混合物作为样品，首先采用经典流通式进样模式，发现不同进样量和梯度洗脱中等度保持的流动相初始比例差异会带来明显的色谱图结果差异，见图 1。
图 1.（A）使用 FT 进样时，进样体积为 2 μL 至 10 μL 时的色谱图比较。将等度保持设置为 10% B（深蓝色）或 20% B（浅蓝色）3 min，然后开始梯度，在 276 nm 处记录 UV 吸收。（B）放大 3 倍的色谱图，显示峰 3 和 4 的分辨率。
实验表明，经典的流通式进样模式下，只有进样量为 2 μL 时，才能获得合适的峰形和分离度，结合使用高灵敏度 DAD 也不能获得足够的检测限。而在 5 μL 和 10 μL 进样体积下，乙腈浓度从 10% 增加到 20%，各峰形及分离度均不佳，这主要是因为分析物溶解在 DCM 中，进样体积增加，导致分析物在柱头上的捕获更不充分，可见进样体积对分析物聚焦有很大影响。
针对这类样品，传统解决溶剂效应的方式有：
1、使用较弱的混溶溶剂稀释样品溶液；
2、降低进样体积；
3、三明治进样或 co-injection 技术。
三明治进样或 co-injection 技术，是在吸样之前抽取一段水填充 Loop，使样品通过低洗脱溶剂聚焦在柱头上或是使用进样程序将样品与初始流动相混合，从而降低样品溶剂的整体强度。显然，这两个想法可以结合起来，并且可以调整其中吸入的液体的组成以获得最佳结果。遗憾的是，样品定量环中需有额外的溶剂填充，而这些进样技术的最大进样体积有限。以上这些方法即使让峰形有所改善，也都会导致方法检测限受到影响。当然除了以上方法外，若有更合适的溶剂可选，可蒸发强溶剂并用新的溶剂重新溶解分析物，但其过程可能很费力并且可能造成分析物损失。也有文献中表示可采用在线固相萃取方式，trap 柱捕获分析物，随后在分析色谱柱上进行分离，但是这需要更复杂的仪器硬件和至少两根填料色谱柱，方法优化复杂，还需考查回收率等。
安捷伦 G7167C hybrid multisampler 除了经典流通式进样模式（FT）外，还具有全新的 feed 进样模式（FI）。feed 进样模式可以减少样品溶剂对分析物的洗脱，因为它使得样品溶剂与洗脱液在柱前混合，这种短暂的稀释与初始条件下分析物被色谱柱充分捕获相结合，允许我们使用非常强的样品溶剂，且不会产生额外的峰展宽或畸变。两种注射方法的原理如图 2 所示，在流通式进样时，通过切换自动进样器的进样阀，存储在自动进样器样品定量环中的样品将会成为流路的一部分，以“液塞”的形式被流动相带入色谱柱。采取 feed 进样模式，样品会以一定速率（feed 速度）不断被打入系统，在 feed 进样期间，液相输液泵流量会因有来自于进样器的流量而减少，从而可以保持总流速不变。
图 2. 样品注入原理。(A) 流通式进样 FT；(B) Feed 进样 FI；流动相（橙色）的流向为从左往右，样品（蓝色）
FEED 进样速度的优化
该实验中，作者对比了进样器不同设置下进样 10 μL 样品所得的色谱图。在图 1 中，20% 高乙腈浓度与 FT 注射相结合时会导致所有峰的干扰，但从图 3 中看到，当采用 feed 进样模式，使用 1% feed 速度时，峰 2-7 峰形及分离度显著改善。同时，从图 3A 可以看出 feed 进样模式下 feed 速度的设置很关键，会直接影响色谱分离效果，对比 10% 乙腈的等度保持分离的色谱图可以看出，进料速度为 10% 的 feed 进样与 FT 进样相比显然没有优势。但是随着 feed 速度从 10% 逐渐调整到 0.5% 时，化合物 2 的峰宽降低至 0.113 分钟，同时，峰对（峰 3 和 4）和三重峰（峰 5-7）的分辨率显著提高，如图 3B 所示。进料速度从 1% 降低到 0.5% 仅显示出轻微的改善，同时注射持续时间加倍。因此，当进料速度为 1% 且在 10% 乙腈下保持等度时，可获得最佳结果。
图 3.（A）不同进样模式对分离性能的影响。在 10 μL 进样体积下，比较 FT 进样与 0.5-10% feed 速度下 FI 所得色谱图。10 % B（暗迹线）或 20 % B（亮迹线）的等度保持设置为 3 min，在 276 nm 处记录 UV 吸收。（B）放大 3 倍的色谱图，显示峰 3 和 4 的分辨率。
等度保留时间的优化
如上所述，FI 应与足够的捕获条件相结合。需要考虑的另一点是梯度开始之前的等度保持持续时间。持续时间取决于进样量、recondition 溶剂量和 feed 速度，而 feed 速度又取决于 HPLC 泵的流速。为了减少等度保持持续时间并进而缩短分析持续时间，最好选择最高的进料速度，同时保持所需的分离性能。当液相泵的流速为 1.5 mL/min，20 μL 进样量下，进料速度为 1% 时，进样时间为 1.3 分钟。但对比图 4 中 2-4 min 的等度保持时间下的色谱图，发现等度保留 2 min 时保留时间最短的化合物（峰 1）的峰不仅显著变宽，而且相对于调整的时间轴提前 0.64 分钟洗脱。为了揭示这种行为的原因，运行了 DCM 溶剂空白（图 4B 中的浅色轨迹），发现 2 min 等度保持时间下，DCM 与峰 1 共洗脱，很明显，DCM 也保留在色谱柱上，因为其峰的前沿随着等度保持时间的增加而延迟，因此等度保持时间要足够长，只有这样才能将 DCM 与目标分析物分离。等度保持时间延长，梯度变化引起的基线下降与 DCM 峰前沿越来越近，这也很好说明了这一点。
图 4. (A) 不同等度保持时间（图中所示）对 1% 进料速度（Vinj = 20 μL）FI 分离性能的影响。此外，还显示了 5 μL FT 进样的 4 倍信号放大图。每个样品溶液色谱图（深色）都叠加了 DCM-空白（浅色）。在 276 nm 处记录 UV 吸收。(B) 227 nm 的波长下，并且未应用时间轴调整或放大，其他条件与 (A) 相同。
提高进样量
当进样速度为 1% 时，自动进样器的进样体积最大为 45 μL，无需手动调节 recondition 溶剂体积。图 5 比较了 feed 进样（45 μL）和 FT 进样（5 μL）下的色谱图，对于关键峰对（峰 3 和 4）的分辨率，FI 显示为 1.48，而 5 μL FT 注射产生的分辨率仅为 1.18。而将 feed 进样（45 μL）与 FT（2 μL）进样色谱图进行比较，在几乎相同的分辨率下，FI 的注射量提高了 22.5 倍，也就是灵敏度可以提高 20 倍以上，这是一个实质性的改进。在该优化条件下，根据 10 ppm 样品溶液峰高响应及噪声来粗略地估算检测限，检测限（LOD）范围在 1-10 ppb 之间。
图 5. 1% feed 速度下 FI 最大进样量（Vinj = 45 μL）和 FT 进样（Vinj = 5 μL）的色谱图的比较。10% 乙腈等度保持 2 min，在 276 nm 处记录 UV 吸收。
在本研究中，作者通过 RPLC 和 UV 检测实现了 DCM 中双酚 A（BPA）和双酚 A 二缩水甘油醚（BADGE）衍生物的大体积进样和分离。最初，经典流通式进样模式下，只有注射量为 2 μL 时才有可能获得合适的峰形和分辨率，而通过 hybrid multisampler 中新的 FI 的进样模式，既克服了强溶剂效应，还可继续增大进样量，从而极大提升了方法灵敏度。总体而言，FI 在受“强溶剂效应”影响的各种应用中具有很高的痕量分析潜力。