负压微环境对人脐静脉血管内皮细胞 新生的影响及其机制

  本文亮点：

        (1) 利用自主研发的全自动三维细胞梯度负压加载装置，对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）进 行间歇负压吸引，观察到体外负压处理可显著促进 HUVEC 的增殖、迁移与成管。

        (2) 推测对 HUVEC 的负压刺激可能通过上调热休克蛋白 90 的表达 ，抑制窖蛋白 1 与内皮型 NOS （eNOS）的结合 ，解除窖蛋白 1 对 eNOS 磷酸化位点 1177 的抑制以激活 eNOS，从而促进 HUVEC 新生。

        【摘要】 目的 探究负压微环境对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）新生的影响及其机制。

             方法 采用实验研究方法。取第 3~5 代对数生长期 HUVEC 进行后续实验。取 3 批细胞，各批次细胞 均分为常规培养 24 h 的正常对照组和单纯负压处理组以及加入 17-丙烯胺基-17-去甲氨基格尔德霉 素（17-AAG）培养 24 h 的单纯 17-AAG 组与 17-AAG+负压处理组，另采用自行设计研发的全自动三维 细胞梯度负压加载装置对 2 个负压处理组细胞行持续 8 h 的间歇负压吸引（负压值为−5.33 kPa，吸引 30 s、暂停 10 s），第 1 个批次细胞处理完成后于培养 0（即刻）、24、48、72 h，采用细胞计数试剂盒 8 法检 测细胞增殖水平，样本数为 6；第 2 个批次细胞处理完成后进行划痕试验，于划痕后 12 h，在倒置相差 显微镜下观察细胞迁移情况后计算细胞迁移率，样本数为 3；第 3 个批次细胞处理完成后进行小管形 成实验，于培养 6 h，在倒置相差显微镜下观察成管情况后计算细胞成管总长度与分支节点数，样本数 为 3。取细胞，分为正常对照组、单纯负压处理组、17-AAG+负压处理组，同前相应组别进行处理，处 理完成后，采用蛋白质印迹法检测细胞中热休克蛋白 90（HSP90）、窖蛋白 1、内皮型一氧化氮合酶 （eNOS）、eNOS 磷酸化位点 1177 蛋白表达并计算 eNOS 磷酸化位点 1177/eNOS 比值（样本数为 3），采用 免疫共沉淀（共沉淀 HSP90 与窖蛋白 1、窖蛋白 1 与 eNOS）与蛋白质印迹法检测各组细胞中窖蛋白 1、 eNOS 的蛋白表达（样本数为 3），采用免疫荧光双重染色法评估细胞中 HSP90 与窖蛋白 1、窖蛋白 1 与 eNOS 的蛋白共定位情况。通过 HADDOCK 2.4 蛋白质-蛋白质对接程序对窖蛋白 1 和 eNOS 进行分子 对接预测。数据分析采用析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD 法。 结果 与正常对照组相 比，单纯 17-AAG 组细胞增殖水平于处理完成后培养 24、48、72 h 均明显降低（P<0.01），单纯负压处理 组 细 胞 增 殖 水 平 于 处 理 完 成 后 培 养 24、48、72 h 均 明 显 升 高（P<0.01）；与 单 纯 17-AAG 组 相 比 ， 17-AAG+负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养 48、72 h 均明显升高（P<0.05 或 P<0.01）；与单 纯负压处理组相比，17-AAG+负压处理组细胞增殖水平于处理完成后培养 24、48、72 h 均明显降低 （P<0.01）。划痕后 12 h，与正常对照组的（39.9±2.7）%相比，单纯 17-AAG 组细胞迁移率明显降低 ［（10.7±2.7）% ，P<0.01］，单 纯 负 压 处 理 组 细 胞 迁 移 率 明 显 升 高［（61.9±2.4）% ，P<0.01］；与 单 纯 17-AAG 组相比，17-AAG+负压处理组细胞迁移率明显升高［（37.7±3.7）%，P<0.01］；与单纯负压处理

   本实验研究旨在探讨负压处理对人脐静脉血 管内皮细胞（HUVEC）新生的影响，并从 HSP90、窖 蛋白 1、eNOS 等分子水平阐明其机制，为临床治疗 慢性创面提供新的参考。

     讨论

     在临床中，NPWT 被广泛应用于皮肤移植后固 定［17］ 、皮瓣修复术后创面封闭［18］ 、烧伤创面清创［19］ 、 下肢软组织重建术后创面封闭［20］ ，同时也是下肢静 脉性溃疡创面［21⁃22］ 、糖尿病足溃疡［23⁃24］ 、压疮［25］ 、术后 切口愈合不良［26］ 等难愈性创面的重要治疗手段。 但是，目前对于 NPWT 在创面愈合中的作用及其机 制尚缺乏全面的认知。体外负压梯度模拟机可以 对体外培养的细胞施加负压作用，从而有助于深入 研究负压促进创面愈合的机制。因此，本课题组自 行设计研发全自动三维细胞梯度负压加载装置，并 基于此构建 NPWT 在细胞中应用的离体模型。本课 题 组 先 进 行 了 SD 大 鼠 全 层 皮 肤 缺 损 创 面 应 用 NPWT 的预实验，结合数字散斑技术，获取负压值与 创面位移量化所得形变量的对应关系，在此基础 上，设计体外细胞负压加载装置，通过激光测距装 置转换并且控制压力。