二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）试剂盒说明书

                                                     微量法100T/48S

注   意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

DAO(EC1.4.3.6)广泛存在于动物（肠粘膜、肺、肝脏、肾脏等）、植物和微生物中。催化多胺氧化为醛，其活性与核酸和蛋白合成密切相关，能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。

测定原理：

DAO催化尸胺产生醛和过氧化氢，外源添加过量的辣根过氧化物酶，催化过氧化氢氧化邻联茴香胺生成氧化型邻联茴香胺，在460nm处有特征吸收峰，通过测定该波长吸光度增加速率，计算DAO活性。

自备实验用品及仪器：

天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体120mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体0.3mL×1支，4℃保存。

试剂二：液体2.5mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体1.2mL×1管，4℃保存。

粗酶液提取：

1.        组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。

2.        细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3.        血清等液体：直接测定。

测定操作表：

1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至460nm，蒸馏水调零。

2、操作表

酶活性计算公式：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmol H₂O₂所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 18×A₄₆₀÷Cpr

（2）按样本质量计算：

酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每克组织每分钟催化产生1nmol H₂O₂所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性（nmol/min/g 鲜重）= ×V反总÷（V样÷V样总×W）÷T= 18×A₄₆₀÷W

（3）按细胞数量计算：

酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每10⁴个细胞每分钟催化产生1nmol H₂O₂所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性（nmol/min/10⁴cell）= ×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量）÷T= 18×A₄₆₀÷细胞数量

(4) 按液体体积计算

酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每毫升血清每分钟催化产生1nmol H₂O₂所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性（nmol/min/mL）= ×V反总÷V样÷T= 18×A₄₆₀

ε：氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数：7.5 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min

b. 用96孔板测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算：

酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmol H₂O₂所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

DAO活性（nmol/min/mg prot）= ×V反总÷（V样×Cpr）÷T= 36×A₄₆₀÷Cpr

（2）按样本质量计算：

酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每克组织每分钟催化产生1nmol H₂O₂所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性（nmol/min/g 鲜重）= ×V反总÷（V样÷V样总×W）÷T= 36×A₄₆₀÷W

（3）按细胞数量计算：

酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每10⁴个细胞每分钟催化产生1nmol H₂O₂所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性（nmol/min/10⁴cell）= ×V反总÷（V样÷V样总×细胞数量）÷T= 36×A₄₆₀÷细胞数量

(4) 按液体体积计算

酶活性定义：在pH7.2，温度为37℃条件下，每毫升血清每分钟催化产生1nmol H₂O₂所需的酶量定义为一个酶活力单位。

DAO活性（nmol/min/mL）= ×V反总÷V样÷T= 36×A₄₆₀

ε：氧化型邻联茴香胺毫摩尔消光系数：7.5 L /mmol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样本体积，0.05mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min

注意事项：

1、如果OD值小于0.01，适当加大提取用样本量；OD值大于0.8，粗酶液可适当稀释，或者减少提取用样本量。

2、样品蛋白质含量需要另外测定。