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猪圆环病毒通用型(PCV-U)核酸检测试剂盒说明书

时间:2024-11-25      阅读:160

【产品名称】

商品名称:猪圆环病毒通用型 (PCV-U)核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法)

Name:Porcine Circovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

猪圆环病是由猪圆环病毒(Porcine Circovirus)引起猪的一种传染性、先天性颤抖和断奶仔猪多系统功能障碍性疾病。该病毒具有 PCV1 和 PCV2 两种血清型,PCV1 无致病性。受 PCV2 感染的断奶仔猪出现呼吸急促、困难、腹泻、贫血、明显的淋巴组织病变及进行性消瘦。

本试剂盒适用于检测肺、淋巴结组织、全血等样本中的猪圆环病毒通用型,用于猪圆环病毒通用型感染的辅   助诊断。

【检验原理】

本试剂盒对猪圆环病毒基因保守区设计特异性引物和探针,用荧光 PCR 技术对猪圆环病毒通用型的 DNA 进行体外扩增检测,用于科研上对可疑感染者的病原学检测。

【试剂组成】

包装规格50T/盒

PCV-U 反应液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

PCV-U 阳性质控品 1.49×10^8拷贝/mL50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管

说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃避光保存,有效期 12 个月。避免反复冻融,冻融次数不超过 5 次;生产日期和失效日期见标签。

【适用仪器】

ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

组织样品采集:采取病死猪(包括流产的死胎))或扑杀猪主要脏器(淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝脏) 装入灭菌 15 mL 离心管中,编号,送实验室。血清样品采集:用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少于 5 ml,置于无菌离心管内,室温或者 37℃倾斜放置自然凝集 20 min ~30 min,2 000 r/min~3 000 r/min 离心 10 min,吸取上清液到新的离心管内备用。精液样品采集:按照 GB/T 25172 的方法采集和保存精液。粪便样品采集:取猪新鲜粪便 1 g,装入 15 mI 灭菌离心管中,加入 5 mL PBS,混匀。细胞培养物:细胞培养物反复冻融 3 次,第 3 次解冻后,将细胞培养物置于 1.5 mL 无 DNA 酶的灭菌离心管内,编号备用。

【保存和运输】

采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h;若需长期保存,应放置-70℃以下保存,冻融不超过 3 次。

【使用方法】

1.样品处理(样本处理区)

1.1样本前处理

组织样品:取 1 g 解冻的组织,剪碎,加入 2 mL PBS 进行研磨,制备组织匀浆,8000 r/min 离心 5 min,取上清用于后续的核酸提取。血清和精液样品无需进行前处理,直接用于核酸提取。粪便样品:3000 r/min 离心 10 min,取上清液,转入 1.5 mL 离心管中,用于后续的核酸提取。细胞培养物:4000 r/min,4℃离心 l0 min,取上清用于后续的核酸提取。

1.2核酸提取

推荐采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的核酸提取试剂(离心柱法)进行核酸提取,请按照试剂说明    书进行操作。

2.试剂配制(试剂准备区)

根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;反应管数每满 10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:

试剂PCV-U 反应液酶液

用量(样本数为 N)19μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,20μL 管。

3.加样(样本处理区)

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。

4.PCR 扩增(核酸扩增区)

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;

4.2设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;

荧光通道选择:检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择 ROX

参比荧光,选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置:

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle95℃2min

245 cycles95℃15sec

60℃30sec

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定(请参照各仪器使用说明书进行设置,以分析 ABI7500 仪器为例)

反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用户可根据实际情况自行调整,Start 值可设在 3~15、End 值可设在 5~20,使阈值线位于扩增曲线指数器,阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线),点击 Analyze 自动获得分析结果。

5.2结果判断

阳性:检测通道 Ct 值≤40,且曲线有明显的指数增长曲线; 阴性:样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。

5.3质控标准

阴性质控品:无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示;

阳性质控品:扩增曲线有明显指数增长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。

6.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;

3.阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;

4.病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;

5.不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;

6.试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;

7.本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行;

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化,完-全混匀并短暂离心;

3.反应液应避光保存;

4.反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 35901-2018  猪圆环病毒 2 型荧光 PCR 检测方法[S].

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