【产品名称】

通用名称：猪多杀性巴氏杆菌（SPA）核酸检测试剂盒(荧光 PCR 法) 

Name：Swine Pasteurellosis Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包装规格】50T/盒

【预期用途】

多杀性巴氏杆菌是一种常见病原菌，可感染猪、牛、家禽等多种动物，引起猪肺疫、牛出血性败血症、禽霍   乱等多种临床疾病[1]。

本试剂盒适用于检测气管分泌物拭子、肺组织等样本中的猪多杀性巴氏杆菌，用于猪多杀性巴氏杆菌感染的   辅助诊断。

【检验原理】

本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，设计一对猪多杀性巴氏杆菌特异性引物，结合一条特异性探针[2]，用荧光 PCR 技术对猪多杀性巴氏杆菌的 DNA 进行体外扩增检测，用于科研实验中对可疑感染者的病原学检测。

【试剂组成】

包装规格50T/盒

SPA 反应液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

SPA 阳性质控品50μL ×1 管

阴性质控品250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。

【适用仪器】

ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。

【标本采集】

病死或扑杀猪，无菌采集肺病变部位或病变/非病变部位交界处的样品；生猪灭菌棉拭子沾取气管分泌物，   放入无菌试管中

【保存和运输】

上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输， 严禁反复冻融。

【使用方法】

1.样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

组织样品：称取样品约 1g，手术剪剪碎混匀后于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨，待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中，8000rpm 离心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中

1.2核酸提取

推荐采用优利科（上海）生命科学有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请按照    试剂说明书进行操作。

2.试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂SPA 反应液酶液

用量（样本数为 N）20μL1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，21μL/管。

3.加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4.PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择

ROX 参比荧光，选择 None 即可。

4.3推荐循环参数设置：

步骤循环数温度时间收集荧光信号

11 cycle95℃10min否

240 cycles94℃15sec否

55℃30sec是

5.结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2结果判断

阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；

可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤38，且曲线有明显的增长曲线， 判定为阳性，否则为阴性；

阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。

6.质控标准

阴性质控品：Ct 值>38 或无 Ct 值；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

7.检测方法的局限性

1.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

2.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

3.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

4.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

5.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

6.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

7.本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完-全混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

【参考文献】

[1]曾静雯, 刘慧芳, 沈琴芳, 等. 多杀性巴氏杆菌鉴定与特性研究的分子生物学方法[J]. 中国兽药杂志, 2006.

[2]李鹏, 马艳娇, 夏伟, 等. 猪肺炎支原体、多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌三重 PCR 检测方法的建立. 中国预防兽医学报, 2010.