新品推荐|多聚半乳糖醛酸酶(PG)试剂盒
时间:2023-04-03 阅读:2320
关于新品推荐|多聚半乳糖醛酸酶(PG)试剂盒说明书
微量法100T/48S
注 意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
多聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)是一种细胞壁结合蛋白,可以催化果胶分子中α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解,参与果胶的降解,使细胞壁结构解体,导致果实软化,与果实成熟、叶和花的脱落、病原物防御,细胞伸展发育以及木质化有关,在植物抗病性和食品贮藏保鲜领域具有较高的研究价值。
测定原理:
多聚半乳糖醛酸酶水解果胶酸生成半乳糖醛酸,具有还原性醛基,与DNS试剂反应生成红棕色物质,在540nm有特征吸收峰,测定540nm处吸光值变化可计算得多聚半乳糖醛酸酶活性。
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。
试剂组成和配制:
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体8mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体15mL×1瓶,4℃避光保存。
酶液提取:
1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。16000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后16000g,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。
3.培养液:直接检测。
测定操作表:
对照管 | 测定管 | |
样本(μL) | 30 | |
煮沸样本(μL) | 30 | |
试剂一(μL) | 120 | |
蒸馏水 | 120 | |
40℃水浴30min | ||
试剂二(μL) | 150 | 150 |
沸水浴5min,冰浴或自来水冷却,取200μL于微量石英比色皿/96孔板测定540nm处吸光值A,△A=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。 |
酶活性计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y = 3.9642x - 0.008;R2 = 0.9996;x为标准品浓度,mg/mL;y为吸光值。
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在40℃,pH6.0条件下,每毫克蛋白每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
PG活性(mg/h/mg prot)= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷(V样×Cpr)÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:在40℃,pH6.0条件下,每克样本每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
PG活性(mg/h/g 鲜重)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷W
3.按液体体积计算
酶活性定义:在40℃,pH6.0条件下,每毫升培养液每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
PG活性(mg/h/mL)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷V样÷T=2.523×(ΔA+0.008)
4. 按细胞数量计算
酶活性定义:在40℃,pH6.0条件下,每104个细胞每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
PG活性(mg/h/104cell)=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷细胞数量
V反总:反应总体积,0.15mL;V样:反应中样本体积,0.03mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,0.5h
b. 用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y = 1.9821x - 0.008,R2 = 0.9996;x为标准品浓度,mg/mL;y为吸光值。
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在40℃,pH6.0条件下,每毫克蛋白每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。
PG活性(mg/h/mg prot)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷(V样×Cpr)÷T
= 5.045×(ΔA+0.008)÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:在40℃,pH6.0条件下,每克样本每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位(U)。
PG活性(mg/h/g 鲜重)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷(V样×W÷V样总)÷T
= 5.045×(ΔA+0.008)÷W
3.按液体体积计算
酶活性定义:在40℃,pH6.0条件下,每毫升培养液每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位(U)。
PG活性(mg/h/mL)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷V样÷T=5.045×(ΔA+0.008)
4. 按细胞数量计算
酶活性定义:在40℃,pH6.0条件下,每104个细胞每小时分解果胶酸产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位(U)。
PG活性(mg/h/104cell)=(ΔA+0.008) ÷1.9821×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)÷T
= 5.045×(ΔA+0.008)÷细胞数量
V反总:反应总体积,0.15mL;V样:反应中样本体积,0.03mL;V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W,样本质量,g;T:反应时间,0.5h
注意事项:
煮沸样本建议将样本在沸水中煮沸10分钟,以将酶彻di灭活。
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