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猪血凝性脑脊髓炎病毒探针法RT-PCR试剂盒
产品名称：猪血凝性脑脊髓炎病毒探针法RT-PCR试剂盒
英文名称：Porcine Hemagglultinating Encephalomyelitis Virus(PHEV) Probe qRT-PCR Kit
猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine Hemagglultinating Encephalomyelitis Virus,PHEV)是一种 RNA 病毒，会引起血凝性脑脊髓炎，是猪的一种急性传染病，发生于出生后 4-7 天的仔猪，体温短暂升高，先是食欲废绝，随后出现嗜睡、呕吐、便秘。病猪背毛倒立、四肢蓝色，有部分病猪打喷嚏、咳嗽、磨牙。1-3 天后出现中枢神经症状、步态不稳、趴地、发抖或痉挛、后肢逐渐麻痹。感觉过敏，遇突然声响或扰动便发出嚎叫，最后病猪侧卧，四肢做游泳动作，呼吸困难， 眼失明，眼球震颤、昏迷死亡，因此猪血凝性脑脊髓炎病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品就是以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测的试剂盒,它具有下列特点:
1. 即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，分析灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据猪血凝性脑脊髓炎病毒高度保守区设计，不会跟其他 病毒的 RNA 发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。
6. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。
7. 本产品只能用于科研。
【试剂组成】
成分 | 包装 |
探针法qRT-PCR 缓冲液 | 500 μL（白盖） |
探针法qRT-PCR 酶混合液 | 100 μL（红盖） |
荧光PCR 专用模板稀释液 | 1 mL（绿盖） |
PHEV探针法 qRT-PCR引物-探针混合液 | 150 μL（棕色管 |
PHEV探针法qRT-PCR阳性对照(1×10E7 拷贝/μL) | 50 μL（黄盖） |
使用手册 | 1份 |
【运输及保存】
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
【自备试剂】样品 RNA，超纯水。
【样本要求】
1. 新鲜采集的咽/拭子、鼻/拭子标本，并使用灭菌生理盐水悬浮。
2. 患病动物的脑、心、肝、脾、肺、肾、扁桃体等病理组织。
3. 标本收集后若不能立即检测，可置于2～8℃冷藏过夜保存；如需长期保存，标本应冻存于-20℃～-80℃。
4. 标本保存期间应避免反复冻融。
【注意事项】
一、稀释标准曲线样品（以 10E1-10E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能
污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本 产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同。
3. 在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
7. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的是 PC（样品制备阳性对照）和 NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的 1000 倍稀释液10μL 再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 RT-PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板）， 6 个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个RT-PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 RT-PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）：
成分/每管 | 样品管 N+2 个 | RT-PCR 阴性对照 | 标准曲线样品管 （1-6 管） |
探针法qRT-PCR 缓冲液 | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
探针法qRT-PCR 酶混合液 | 2 μL | 2 μL | 2 μL |
PHEV探针法 qRT-PCR引物- 探针混合液 | 3 μL | 3 μL | 3 μL |
N+2 个待测 RNA 样本 | 5 μL | 不加 | 不加 |
自备超纯水 | 不加 | 5 μL | 不加 |
第 6 步所得标准曲线样品稀释液 （1-6 号） |
不加 |
不加 | 5μL（1 号样到 1 号管，2 号样到 2号管…） |
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 RT-PCR：
过程 | 温度 | 时间 |
逆转录 | 50℃ | 20 min |
预变性 | 95℃ | 10 min |
RT-PCR 反应 （45 个循环） | 95℃ | 15 sec |
57℃ | 30 sec | |
72℃ | 30 sec（采集 FAM 通道的荧光信号） |
五、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 36。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 36 则为阳性。如果在 36-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct
值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。
