摘要：建立超液相色谱仪——串联质谱法鉴别十字花科植物中硫代葡萄糖苷的分析方法。采用70％甲醇水溶液提取白芥种子中的硫代葡萄糖苷，通过反相C12柱分离，电喷雾一离子阱一飞行时间质谱测定。利用硫代葡萄糖苷二级质谱裂解产生的m／z l95，241，259，275，291特征离子和伴随产生的80，162，163，196，242 Da中性分子丢失规律，共鉴别出5种硫代葡萄糖苷。
    硫代葡萄糖苷（简称硫苷）是广泛存在于十字花科植物中的含硫次级代谢产物，主要分布于植物的根、茎和叶中。当植物细胞受到破坏（如挤压、虫咬等）后，硫苷与植物内生的黑芥子酶接触，降解产生异硫氰酸酯、恶唑烷酮和硫氰酸酯等化合物¨J，其中异硫氰酸酯具有良好的生物活性，而且对人畜无害。因此硫苷及其降解产物的研究引起了科学工作者的浓厚兴趣。根据侧链R基团的不同，目前已发现约l20种硫苷，其中有多种具有抗癌、抗肿瘤、杀菌和杀虫活性的异硫氰酸酯，如吴华等比较几种异硫氰酸酯的杀线虫活性，发现烯丙基和丙烯酰基异硫氰酸酯具有良好的杀线虫活性。大量研究表明甲硫基己基异硫氰酸酯等具有良好的抗肿瘤活性，是非常具有潜力的抗癌药物。
    硫苷的检测方法主要是传统的化学方法和现代的仪器分析手段。化学方法耗时、误差大、操作繁琐，只能测定硫苷总量。液相色谱法具有很高的分离效率，但对于硫苷单体鉴别需要对照品，无法满足
快速鉴别硫苷的需要。笔者采用超液相色谱一离子阱-飞行时间质谱联用技术，既能分离硫苷，又能准确、快速鉴别硫苷。对于硫苷及降解产物的研究具有重要意义，同时又能够提高工作效率。1实验部分
1.1主要仪器与试剂
    超液相色谱仪-离子阱-飞行时间质谱仪： LCMS—IT-TOF型，日本岛津公司；
    数显恒温水浴锅：HH-6型，
    真空干燥箱：VD23型，德国81NDER公司；    电子天平：AUY220型，日本岛津公司；
    超声波清洗器：KS-120E1型
    旋转蒸发仪：R-216型，瑞士BUCHl公司；
    台式高速离心机：H-1650型，
    研磨机：All基本型，德国IKA公司；    白芥种子：产地为湖北武汉；
    正己烷、氯仿、乙酸铵、甲酸：分析纯
    甲醇：色谱纯，美国Fisher公司；
    实验用水为美国Pall公司Purelab Ultra超纯水系统制备的超纯水，电阻率为18.2 MQ•cm。
1.2硫代葡萄糖苷提取
    白芥种子在105℃干燥3h，以灭活黑芥子酶保护硫苷。干燥种子经粉碎后，过420μm筛。称取粗粉约50g于锥形瓶中，依次用正己烷50mL，氯仿50mL各3次除脂。残渣经真空干燥，用300mL沸腾的70％甲醇水溶液浸泡，超声提取30min，连续2次，合并提取液，静置至室温。提取液经离心分离，将清液真空下浓缩至原体积的20％。取lmL浓缩液经石墨化碳脱色，滤液供超液相色谱-串联质谱分析。
1.3流动相配制
    用电子天平准确称量乙酸铵0.385g，置于1L量瓶中，加入lmL甲酸，用水溶解定容后，经0.22μm微膜过滤，超声波脱气后使用。
l.4液质联用分析条件    （1）UPLC条件
    ODS Cl8柱（100mmx 2.1mm，3.5μm，日本岛津公司）；柱温：30℃；流动相A：5mmol／L乙酸铵～1‰甲酸溶液；流动相B：甲醇；流动相流速：0.2 mL／min；进样体积：20μL；梯度洗脱：0～3 min,98%A；3～25min，98％～20％A；25—30min，20％～20％A；30—35min，20％-98％A。
    （2）MS条件
    ESl负离子模式；电压：-3.5kV；雾化气： N2，流量为1.5 L／min；干燥气压力：100kPa；碰撞气：Ar；检测器电压：1.7 kV；Heat Block温度：200℃；CDL温度：200℃；一级质谱扫描范围：m／z300~700；母离子扫描范围：m／z 315～650；二级质谱扫描范围：m／z 50~700；离子累积时间：l0ms； CID碰撞能量：100％；碰撞气能量：l00％。
2结果与讨论
2.1分析条件选择
    硫苷在水溶液中是亲水性阴离子化合物，在反
相色谱柱中，保留时间短。优化实验发现，在ODS— c18柱上采用流动相A（5mmol／L的乙酸铵+0.1％甲酸）和流动相B（甲醇）能够很好分离，并且有很好的质谱响应。质谱Heat Block和CDL温度采用200℃，温度过高会造成硫苷裂解，过低则影响离子化和脱溶剂化效果。为获得比较丰富的二级离子碎片信息，CID碰撞能量和碰撞气能量均采用100％。2.2分析结果
    按照l.4分析条件检测白芥种子提取液，获取硫苷提取离子流色谱图及其一、二级质谱图（见图1～图ll）。根据裂解机理，并参考文献[9一l2]，共鉴定出5种硫苷，结果见表1。

2.3质谱碎片离子裂解机理
    二级质谱特征离子，对于鉴别硫苷具有重要意义。在MS2中，母离子先后失去S0。（80 Da）和 C6H10O5（162Da）后产生242Da中性分子丢失，氢重排后出现相对应的R-C（SH）一N—O-离子。另一裂解途径是硫苷上的氢发生重排后，失去 C6H1105（163Da）和C6H1205S（196Da）中性碎片。与此同时，二级质谱中还能观察到m／z l95，241，259，275，291的特征离子，这些离子是由于硫与相邻碳原子发生断裂，并伴有氢重排形成的。
    硫代葡萄糖苷负离子模式下主要特征二级碎片离子裂解机理见图12
3结语
    利用液相色谱仪一串联质谱技术快速、、准确的分离与鉴定十字花科植物中硫代葡萄糖苷，对硫代葡萄糖苷二级质谱80，162，163，196，242 Da中性分子丢失和m／z l95，241，259，275，291特征离子裂解机理进行了阐述和总结，能够准确推测硫代葡萄糖苷化学结构，对于十字花科植物的开发与利用具有重要意义。

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