产品名称：abcam重组Drebrin抗体[EPR12634] (ab178408)现货供应

产品货号：ab178408

产品品牌：abcam

实验流程：

蛋白质印迹实验方案：

1. 样品裂解

l 从细胞培养物中制备裂解物

(1) 将细胞培养皿放在冰上，用冰冷的PBS清洗细胞。

(2) 吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 10 mL7细胞/100 mm 培养皿/150 cm2瓶;每 5x10 0.5 mL6细胞/60 mm 培养皿/75 cm2烧瓶）。

(3) 使用冷塑料细胞刮刀从培养皿上刮下贴壁细胞，然后轻轻地将细胞悬液转移到预冷的微量离心管中。或者，在微量离心管中的裂解缓冲液中重悬之前，可以胰蛋白酶消化并用PBS洗涤细胞。

(4) 在 4°C 下保持恒定搅拌 30 分钟。

(5) 在4°C的微量离心机中离心细胞悬液。 您可能需要根据细胞类型改变离心力和时间;指南是在 14,000–17,000 g 下 5 分钟，但这必须为您的实验确定（白细胞需要非常轻的离心）。

(6) 轻轻地从离心机中取出试管并放在冰上，吸出上清液并放入保持在冰上的新鲜试管中，然后丢弃沉淀。

l 从组织中制备裂解物

(1) 用干净的工具解剖感兴趣的组织，最好在冰上解剖，并尽快防止蛋白酶降解。

(2) 将组织放入圆底微量离心管或Eppendorf管中，并浸入液氮中以快速冷冻。将样品储存在 -80°C 以备后用，或放在冰上立即均质化。对于~5mg组织，向试管中快速加入~300μL冰冷裂解缓冲液，用电动均质器匀浆，用另一个2×200μL裂解缓冲液冲洗刀片两次，然后在4°C下保持恒定搅拌2小时（例如，放在冰箱中的轨道振荡器上）。裂解缓冲液的体积必须根据存在的组织量来确定;蛋白质提取物不应太稀释，以免蛋白质损失和大量样品上样到凝胶上。浓度下限为 0.1 mg/mL，最佳浓度为 1–5 mg/mL。

(3) 在微量离心机中以 14,000–17,000 g 在 4°C 下离心 5–10 分钟。轻轻地从离心机中取出试管，放在冰上，吸出上清液，然后放入保持在冰上的新鲜试管中;丢弃颗粒。

2. 样品制备

(1) 除去少量裂解物以进行蛋白质定量测定。确定每种细胞裂解物的蛋白质浓度。

(2) 确定要加载多少蛋白质并加入等体积的 2X Laemmli 样品缓冲液。

(3) 我们建议使用以下方法对样品进行还原和变性，除非在线抗体数据表表明应使用非还原和非变性条件。

(4) 为了减少样品和变性，将每个细胞裂解物在样品缓冲液中在100°C下煮沸5分钟。裂解物可以等分并储存在 -20°C 以备将来使用。

3. 抗体染色

(1) 使用封闭缓冲液在室温下封闭膜1小时或在4°C下过夜。

(2) 在封闭缓冲液中用适当稀释的一抗孵育膜。我们建议在 4°C 下孵育过夜;其他条件可以优化。

(3) 用三次TBST洗涤膜，每次5分钟。

(4) 在室温下，在封闭缓冲液中用推荐的偶联二抗稀释液孵育膜1小时。

(5) 用三次TBST洗涤膜，每次5分钟。

(6) 对于信号开发，请遵循套件制造商的建议。去除多余的试剂并用透明保鲜膜覆盖膜。

(7) 使用用于化学发光的暗室显影技术或用于比色检测的普通图像扫描方法获取图像。

相关文献：

[1] Brezovakova V et al. Astrocytes Derived from Familial and Sporadic Alzheimer's Disease iPSCs Show Altered Calcium Signaling and Respond Differently to Misfolded Protein Tau. Cells 11:N/A (2022).

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