感受态细胞制备原理与举例
时间:2024-10-14 阅读:133
一、感受态细胞
即受体细胞通过理化方法处理,使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态的细胞。
二、感受态细胞制备原理
将快速生长的大肠杆菌置于经低温0℃预处理的低渗氯化钙溶液中,便会造成细胞膨胀(渗透作用),同时,Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构,促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,离开所在区域,诱导细胞成为感受态细胞。
大肠杆菌DH5α感受态细胞
三、大肠杆菌DH5α感受态制备实验步骤
实验步骤一
从-80℃冰箱中取出保种的DH5α菌株,用灭菌的枪头吸取少量保菌液加入至合适的LB液体培养基中,在LB固体培养基进行涂板处理,置于37℃培养箱中过夜培养。
实验步骤二
次日,从LB固体培养基上挑取湿润,圆滑的大肠杆菌单菌落,接种于无抗生素的5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养过夜,至对数生长后期。将该菌悬液以1:100~1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3h至OD600=0.3-0.5左右。(注:此步必要时可在显微镜下镜检菌细胞是否形态一致,有无杂菌污染。)
实验步骤三
在无菌条件下将菌液转移到冰上预冷的离心管中,冰上放置10-30min,使培养物冷却至0℃,然后4℃,4000rpm/min离心10min;
实验步骤四
弃掉上清,倒置1 min,以便将培养液流尽;
实验步骤五
用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2溶液10 ml轻轻悬浮细胞,充分混匀,冰上放置30 min后,4℃下4000rpm/min离心10min;
实验步骤六
弃掉上清,并倒置1 min,以便最后的培养液流尽;
实验步骤七
加入4 ml预冷含15%甘油(已灭菌处理)的0.1 mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液;
实验步骤八
感受态细胞100 μL分装,标记贴标签,贮存于-80 ℃保存备用。
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