全蛋白的提取方法和注意事项
时间：2024-10-25 阅读：165
一、全蛋白的提取方法主要包括以下几种。
全蛋白的提取方法一：
细胞准备和清洗：首先，准备近乎长满的细胞，例如10cm大皿中的细胞。使用预冷的PBS清洗细胞1-2次，并弃去PBS。
全蛋白的提取方法二：
细胞裂解：加入适量的裂解液，如RIPA裂解液（强），并加入PMSF以抑制蛋白酶活性。如果需要提取磷酸化蛋白，还需加入磷酸酶抑制剂。裂解液配好后，将细胞在4℃下裂解15分钟。
全蛋白的提取方法三：
超声破碎：将裂解后的细胞用超声波破碎仪处理1-2分钟，功率保持在20-30%，保持4℃。
全蛋白的提取方法四：
离心：超声破碎后，将样品在4℃、12000rpm下离心15分钟。
全蛋白的提取方法五：
蛋白变性：吸取上清液至新的EP管中，加入适量的5x loading buffer，金属浴100℃加热10分钟使蛋白变性。
全蛋白的提取方法六：
存放：将变性后的蛋白存至-80℃冰箱。
二、全蛋白提取的注意事项包括：
细胞状态和数量：确保细胞处于良好的生长状态，并在收集后尽快进行裂解，以避免蛋白质的降解和损失。
裂解条件：选择合适的裂解方法，避免对蛋白质的影响。注意控制温度、pH值和离子浓度等因素，以确保蛋白质的稳定性和可溶性。
离心条件：离心时需提前开离心机预冷，确保在4℃下进行，以避免蛋白质的变性。
蛋白变性：在加入loading buffer后，需充分加热使蛋白变性，确保蛋白电泳时的稳定性。
存放条件：将变性后的蛋白存放在-80℃冰箱中，以长期保存。
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