一、引物探针的使用步骤‌

引物探针使用步骤一：

‌设计引物和探针‌：首先需要根据目标DNA序列设计特异性引物和探针。引物的长度一般为20-25个核苷酸，探针的长度一般为15-25个核苷酸。设计时要注意避免非特异性扩增，确保引物的特异性和探针的Tm值比引物Tm值高8-10°C‌。

引物探针使用步骤二：

‌提取模板DNA‌：从待测样本中提取DNA，作为PCR反应的模板。确保模板DNA的质量和浓度，以获得可靠的实验结果‌。

引物探针使用步骤三：

‌配制PCR反应体系‌：根据实验需求，配制含有引物、探针、dNTPs、DNA聚合酶等试剂的PCR反应体系。调整各试剂的浓度和比例，确保反应体系的准确性‌。

引物探针使用步骤四：

‌PCR扩增‌：将PCR反应体系放入PCR仪中，进行扩增。一般包括以下步骤：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，退火温度（一般为55℃）退火30秒，72℃延伸30秒，进行30-40个循环；最后72℃延伸5分钟‌。

引物探针使用步骤五：

‌分析PCR产物‌：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带的大小和亮度，初步判断实验结果。然后通过荧光检测仪分析荧光信号，实现对目标序列的定量分析‌。

二、‌引物探针的设计原则和注意事项‌：

1. ‌引物长度‌：一般为18-24 bp，过长或过短都会影响扩增效率‌。

2. ‌Tm值‌：荧光定量PCR引物的Tm一般介于59~68°C之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2°C‌。

3. ‌GC含量‌：引物的GC含量应在40%~60%之间，上下游引物的GC含量不能相差太大‌。

4. ‌避免二级结构‌：扩增产物不能形成二级结构，选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域‌。

5. ‌引物自身及引物之间不应存在互补序列‌：引物自身及引物之间不应存在超过4个连续互补的碱基，以防止引物二聚体的形成‌。

通过掌握这些基本步骤和设计原则，可以确保引物探针验证实验的准确性和高效性。如需购买探针请联系——天津益元利康生物科技有限公司！