如何降低非特异性扩增?
时间:2024-11-25 阅读:76
一、扩增方式
扩增方式一般有两种,对称扩增和不对称扩增。
1、对称扩增
使用等量的引物进行PCR扩增,扩增产物量随着PCR循环呈指数增长,一般的PCR,使用的都是这种方式。
由于TaqDNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性,在PCR扩增的过程中会水解探针,导致探针被耗尽,无法用于熔曲分析;若使用抗酶切修饰的探针,可一定程度降低水解,但由于探针阻碍了聚合酶通过,扩增效率会大幅下降。
对称扩增产生的互补双链,会与探针竞争结合靶序列,不利于探针结合到靶序列上,熔曲分析可能会出现异常。
优点:灵敏度高
缺点:一般搭配使用媒介探针进行检测,而其他类型探针由于被切割而无法使用。
2、不对称扩增
上下游引物中,有一条引物为过量使用,一条引物xian量使用,在PCR扩增的前期,扩增产物量呈指数增长,待xian量引物耗尽,扩增产物量呈线性增长,产生大量的单链用于探针的结合和熔解曲线分析。
LATE-PCR方法中,由于考虑到引物浓度对引物Tm值的影响,xian量引物由于浓度低,对模板的结合效率下降,从而影响不对称扩增前期的扩增效率,因此对xian量引物的Tm值进行了增加(即加多几个碱基)。
优点:不会消耗探针,探针可用于后续熔解曲线分析
缺点:灵敏度低,一般用于基因检测,不适用于病原检测(病原检测需要高灵敏度)
二、如何降低非特异性扩增?
1、HANDS技术(Homo-Tag Assisted Non-Dimer System,同源加尾无二聚体系统)
通过对引物添加标签,当形成引物二聚体后,由于首尾的序列互补,会形成发夹结构,不再作为模板进行扩增。
2、DPO引物(Dual Priming Oligonucleotide,双启动寡核苷酸)
DPO引物主要由三个部分组成,长的 5'端片段、短的3'端片段、中间起连接作用的聚脱氧次黄嘌呤(poly I)。由于脱氧次黄嘌呤与天然碱基结合较弱,因此相当于与模板DNA形成了一个气泡结构。
即使DPO引物的较长的 5'端部分结合到了非靶序列部位,但由于热力学限制,3’端部分阻止了非特异结合并有效地阻断了延伸。同样由于热力学限制,单独的3'端部分在PCR退火温度下不能结合到靶序列上。从而减少引物二聚体的扩增。
3、touch-down技术
即降落PCR,在退火阶段,采用逐级降温的方式,能有效减少非特异性扩增。温度较高时,由于非特异性结合的结合力较弱,不利于非特异性扩增,特异性扩增占优势。
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