慢病毒包装实验

慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 研究以及活体动物实验中。

一、实验流程

图  1、 慢病毒包装实验流程图

二、实验仪器与实验材料

psPAX2 质粒，pMD2.G 质粒，pHBLVTM 系列质粒；293T 细胞；wan全培养基；DH5α 菌株；Stbl3 菌株。

三、实验步骤

1. 质粒扩增。将构建好的慢病毒载体和包装质粒使用大抽试剂盒进行质粒的去内毒素抽提，浓度建议不低于 1 μg/μl，A260/280 在 1.7-1.8 间方可用于病毒包装。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提（质粒质量会极大影响后续转染效率和病毒的滴度）。

2. 脂质体转染。转染前一天，在10 cm皿中接种生长状态良好的293T细胞，以第二天汇合度能达到 30% ~ 50% 为宜。24 h 后转染，转染前需要把 DMEM 和慢病毒包装专用转染试剂 LentiFitTM 恢复至室温，使用前需摇匀。每个皿的质粒成分如下：

表 1、慢病毒包装转染体系

用于包装的三个质粒摩尔比通常为 1:1:1，可以根据情况稍加调整。请参考 LentiFitTM 转染试剂说明书进行转染操作，转染后 4-6 h 换新鲜培养基。

3. 病毒收集和离心。转染后 48 h 和 72 h 分别两次收集病毒上清（48 h 收集后置换新鲜培液）， 将收集的上清用 0.45 μm 滤器过滤，然后放于超速离心管中，4 ℃，72000 g 离心 120 min。

4. 病毒重悬和保存。弃上清，500 μl 重悬液重悬病毒沉淀，一周内使用则置于 4 ℃ 保存，如需长时间存放需置于 -80 ℃ 或液氮罐保存。（注：具体重悬体积根据实验需求而定）

5. 滴度测定。在 96 孔板中铺合适数量的 293T 细胞，第二天将慢病毒原液进行梯度稀释后分别感染 293T 细胞，感染 24 h 后换成无病毒的培养液，感染 72 h 后在荧光显微镜下观察结果，对荧光比例合适（10 ~ 30% 之间）的孔进行细胞计数。

滴度计算公式为：滴度（TU/ml）=细胞数 ×荧光百分比×10 3 / 病毒原液体积

四、注意事项

1. 慢病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2 级别）内操作。

2. 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3. 操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有bing毒污染，请立即用 70% 乙醇加 1% 的 SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请于 84 消毒液浸泡后统一处理。

4. 如需要离心，应使用密封性好的离心管， 如有必要请用封口膜封口后离心。

5. 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。

6. 实验完毕用香皂清洗双手。

五、常见问题

1. 影响慢病毒出毒及滴度的原因有哪些？

（1）质粒。包毒前需要对包装及表达质粒进行去内毒素处理，浓度建议不低于 1μg/μl，A260/280 在 1.7-1.8 间；

（2）转染试剂和质粒比例。要用转染效率高，细胞毒性小的转染试剂，转染时质粒间比例得当，建议三质粒包装系统质粒转染时的摩尔比为 1:1:1 可根据目的基因大小进行调整；

（3）目的基因。一般慢病毒包装的目的片段大小在 3 k 以内较为合适，大于 3 k 会降低滴度或超过载体容量无法包装、目的基因本身是否具有毒性也会影响慢病毒的出毒效率；

（4）包装细胞 -293T 细胞的状态。细胞出毒过程中的细胞活力是包装成功及病毒滴度高低的一个重要环节，进行包装转染 293T 细胞前一定要重视细胞是否干净、饱满立体感是否好、铺板是否均匀，细胞密度在 50-60% 时进行包装比较合适；

（5）病毒收集：在 24、48 h 观察细胞及荧光状态，判断是否正常，转染后 48 h 和 72 h 分别两次收集病毒上清（48 h 收集后置换新鲜培液）。

2. 该如何选择合适的慢病毒包装质粒？

慢病毒常用的包装系统是二代三质粒系统，骨架质粒 pSPAX2 和包膜质粒 pMD2.G 是明确的包装质粒。目的基因的表达质粒需要根据实验需求进行选择，主要包括启动子、标签蛋白、荧光和抗性等元件。

（1）目的基因的过表达通常选择 CMV/EF1a 启动子，目的基因的干扰通常选择U6 启动子；

（2）若需要稳转株筛选，则需携带 PURO/BSD/NEO 等抗性筛选基因；

（3）后续需要观察慢病毒感染效率一般需要携带 EGFP/mCherry 等荧光蛋白便于通过显微镜直观监测感染效率；

（4）标签蛋白的选择可以根据不同的实验需求进行选择，如纯化蛋白常使用 His 标签，CO-IP 常使用 Flag/HA/Myc 标签，PULLDOWN 常使用 GST 标签等。