标准GB 5009.296-2023的前身是GB 5009.82-2016,现在食品中维生素A、E继续使用标准GB 5009.82-2016，维生素D单独实行标准GB 5009.296-2023。本文将重点介绍GB 5009.296-2023标准中3个方法实验中的注意要点，与大家分享与交流。

        在方法解读之前，可以先了解下维生素D来源和性质，在后续实验中才能更好的提取目标物。

一、维生素D的来源：

二、维生素A、D、E性质

三、第一法 正相色谱净化-反相液相色谱法的注意要点

1、取样量严格按照标准的不同基质的取样量，因为干法工艺，取样量少会影响均匀性。

2、上机前，为了保护正向硅胶柱，提取液水洗后，必须用无水硫酸镁钠粉末脱水至无水状态。

3、为保证仪器灵敏度，正向色谱进样量：500μL；反相色谱进样量：100μL;

4、浓缩时，大体积石油醚待浓缩液，可选用莱奥12位全自动氮吹浓缩仪，可支持自动定容到1ml，再氮吹到近干；大体积氮吹时，实验员可解放双手，无需值守，并且确保氮吹不会吹到干。防止维生素D附着壁上，影响回收率。

Leowlab SmartVap N12

莱奥12位全自动定量浓缩仪

5、内标法和外标法的选择？首先确定样品是否含有维生素D2和D3.

四、第二法 在线柱切换-反相液相色谱法的注意要点

1、关注仪器灵敏度问题，根据取样量、定容体积、进样量、检测器灵敏度、检出限综合考虑。

2、固相萃取柱填料可选HLB，重点要保证较大的柱容量，耐碱性、耐压性，由于样液皂化条件是碱性的，待净化液属于碱性。

3、标准提到的奶粉、油脂含量高的肉类、粘稠的蜂蜡等制品属于复杂类基质，需要过柱压力较大，选用莱奥48位正压固相萃取仪，针对以上复杂基质，压力相比真空泵负压装置，最高可达100psi，可以轻松快速过柱。

4、固相萃取可选择莱奥48位正压固相萃取仪，可取代实验室常用的真空泵负压萃取装置，能大大缩短萃取时间，提高萃取效率，达到很好的平行性及回收率。

Leowlab Purifier A48

莱奥48位正压固相萃取仪

5、固相萃取仪后的液体，加入适量水，主要是克服色谱溶剂效应，改善峰型；

6、一维色谱柱可选用 PFP(五氟苯基)填料，在同时分离生育酚异构体时使用。

7、二维色谱柱可选PAH(多环芳烃)或固醇类分析C18柱。

8、捕集取柱可选C18或C8，粒径可采用10μm填料，柱长可选用到30mm

五、第三法 液相色谱-串联质谱法的注意要点

1、选择硅胶基质的固相萃取柱，需要注意防水，活化则选择有机溶剂进行活化。

2、同位素内标的选择:维生素 D2-d3、和维生素 D3-d3;，也可使用维生素D2-d6。和维生素 D3;-d6。可综合考虑成本;

3.质谱检测的离子化效率的评估实验必须开展，对于不同的基质，样品是不一样的。

4.质控样品的跟进是必要的，才能验证做的样本结果的准确性。

5、标准提到的奶粉、油脂含量高的肉类、粘稠的蜂蜡等制品属于复杂类基质，需要过柱压力较大，选用莱奥48位正压固相萃取仪，针对以上复杂基质，压力相比真空泵负压装置，最高可达100psi，可以轻松快速过柱。

Leowlab Purifier A48

莱奥48位正压固相萃取仪

六、关于我们

氮气发生器

正压固相萃取仪&氮吹仪

广州莱奥实验室科技有限公司总部位于广州,是一家专注于有机质谱供气及前处理仪器的高科技企业。

团队人员拥有十几年的质谱仪、前处理仪器、氮气发生器从业经历。公司服务于全国食品、制药、临床检验、环境、司法鉴定、科研院所等行业。