qPCR（Quantitative real-time PCR）实验中，模板质量、引物设计、qPCR反应体系、程序设置，均是影响实验成功的重要因素。其中，qPCR的引物设计尤为重要，决定了qPCR扩增效率和扩增产物的特异性，引物设计都有哪些原则和要点，一起来了解一下吧！

qPCR引物设计原则

1. 引物长度一般在18~30 nt之间，扩增产物长度尽量控制在 80~200 bp之间。

引物设计太短会导致非特异扩增，太长则容易形成二级结构(如发夹结构)。扩增产物太长会影响到PCR扩增效率。

2. 引物GC含量控制在40%~60%之间，正反向引物Tm值介于55~65℃之间，正反引物的Tm差值不超过3℃。

3. 引物3′端尽量避免选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发合成效率存在着很大的差异，当末位碱基为A时，即使在错配的情况下，也能引发链合成，而当末位为T时，错配引发效率大大降低。

4. 单个碱基重复≤3个。

引物中四种碱基的分布最好是随机的，尤其3′端避免超过3个连续的G或C，因为3个以上连续的G或C容易在GC富集序列区产生错误引发。

5. 引物设计区域应避开复杂二级结构。

扩增产物单链形成二级结构会影响PCR顺利进行，可用软件（比如RNAstructure）预测靶序列是否存在二级结构，尽量避开该区域设计引物。

6. 引物自身和引物之间应尽量避免碱基连续互补。

引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补，引物自身存在互补序列会形成发夹结构而影响引物与模板的复性结合，而引物之间互补会产生引物二聚体而降低PCR效率甚至影响定量准确性。如果引物二聚体及发夹结构不可避免，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。

7. 引物扩增的是目标特异产物。

qPCR检测最终目的是了解目的基因的丰度，如果出现非特异扩增，定量会不准确。所以设计好引物后需要在序列数据库中比对产物的特异性。


 

qPCR引物设计方法

以上我们了解了qPCR引物设计原则，看上去内容多而复杂，在实际应用中，我们可借助生物学软件完成qPCR引物设计。常用的软件有Primer-BLAST、Primer3、Primer Premier、Primer Express、Beacon Designer、Oligo 7等，NCBI网站的Primer-BLAST无需下载软件，可以直接打开网页设计引物，除了常规引物参数设置外，还可以设置跨越内含子引物和检测引物的特异性，应用非常广泛。接下来我们通过以下三步来学习利用Primer-BLAST成功设计qPCR引物。

01 查找目的基因序列

qPCR方法可以检测基因组DNA含量，也可以检测基因转录水平的表达量（RNA的含量），后者需要先提取组织部位的RNA，进行反转录得到cDNA，再做检测。所以设计引物之前需要明确实验目的，明确模板是DNA还是cDNA，不同类型模板，需要下载的序列是不同的。基因表达量的检测是目前qPCR的主要应用方向，因此今天以基因表达量分析为例介绍qPCR引物的设计方法。

以水稻产量基因GW2为例设计引物，在NCBI数据库主页Gene数据库中搜索GW2，获得该基因mRNA的Accession号和FASTA序列。

02 设计引物

打开NCBI的Primer-BLAST页面，出现PCR Template，Primer Parameters，Exon/intron selection，Primer Pair Specificity Checking Parameters四种参数设置。

① PCR Template是针对模板的设置，设计人员可以选择输入accession号、FASTA序列或者上传FASTA序列文件等方式导入模板序列，优先输入accession号，这种方式在输出页面可以直观地展现引物对应外显子的位置。Range可以指出引物位置范围，如果我们只想在CDS区设计引物，可以把范围直接锁定在CDS区，此处未填写代表全长序列都参与设计。

② Primer Parameters是针对引物参数的设置，本次为新引物设计，无需填写引物序列。PCR产物大小建议设置为80~200 bp，如果模板复杂较难设置出合适的引物，产物大小可适当延长至300 bp。输出引物对数和引物熔解温度（Tm值）选择默认设置即可。

③ Exon/intron selection是针对基因组序列对mRNA序列扩增结果有影响而设计的跨内含子引物设计方案，参数包括引物是否跨越内含子或者exon-exon拼接点，设置参数越多，可能导致设计不出合适引物。所以这栏建议选择默认设置，后续通过引物与外显子的相对位置来筛选引物。

④ Primer Pair Specificity Checking Parameters是针对引物特异性筛选的参数设置，数据库和物种根据实际情况选择，这里选择了Refseq mRNA和水稻。有些基因可能存在可变剪切而有多个转录本，Allow splice variants处打勾代表可以扩增所有转录本（此时PCR template处应输入mRNA序列而非accession号）。其他参数选默认设置。

⑤ 点击Get Primers，即自动生成合适引物。我们看到页面中，Specificity of primers处描述“Primer pairs are specific to input template as no other targets were found in selected database: Refseq mRNA (Organism limited to Oryza sativa Japonica Group)”，代表10对引物均可特异性结合靶序列，我们可以选择不同区域的两对跨内含子的引物进行后续预实验验证。

03 引物预实验验证

软件设计的引物在理论上是可用的，而实际实验中，会有很多未知的因素而无法得到理想结果，所以强烈建议用预实验验证引物的有效性。

cDNA原液以4为倍数进行倍比稀释，得到4~6个梯度，同时用预选的引物对进行qPCR扩增（要设置NTC）。结束后观察熔解曲线的特异性和标准曲线的扩增效率，如果熔解曲线单一、尖锐，初步判断产物是特异的，扩增效率要介于90%~110%之间，越接近100%，定量越准确。满足这些条件后，建议把PCR产物（谨防污染）做一代测序验证序列的特异性。最后，根据实验需要选择合适的qPCR引物用于后续正式实验即可。

补充Tips：

1. 这里介绍了一般的qPCR引物设计流程，如果仍没有筛选到合适的引物，需要针对性的调整参数，必要时需要在Advanced parameters调整参数以设计到合适的引物。

2. 在表达量研究实验中，基因组残留对后续定量结果的影响是必须考虑的因素，可以有两种方式来解决此问题，其中一种方式在引物设计里介绍过，即设计跨越内含子的引物使基因组序列无法被扩增，另一种方式是在RNA提取过程中增加基因组去除的步骤，同时反转录实验前也增加基因组去除的步骤以消除残留DNA得到准确定量结果，后一种方式无需考虑引物设计的位置，引物设计更加简化。

相信大家get到了利用Primer-BLAST设计qPCR引物的技术要点，引物设计非常重要，稳定可靠、特异、灵敏的荧光定量试剂也很重要。TIANGEN的荧光定量产品质量可靠、定量准确，一直以来受到广大客户的信赖。