应该如何避免在PCR实验中管子变型?
时间:2017-03-17 阅读:9612
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首先,倒置管子变性的罪魁祸首是PCR仪的热盖,热盖的作用是为了防止PCR反应过程中反应液的蒸发,水汽在管盖上凝结。
早期的PCR仪没有热盖,PCR加热过程中反应液蒸发形成水汽在管盖上凝结,导致PCR反应体系随着循环的进行不断减少,影响PCR反应的正常进行。为了防止PCR反应液的蒸发,会在配置好的PCR反应液中加入石蜡油或矿物油。但是反应结束以后,石蜡油不好清除赶干净,对接下来的步骤有所影响。
后来出现了带热盖的PCR仪,热盖的作用并不是防止蒸发,而是防止蒸发的水汽在管上凝结。因为管盖顶部有热源加热使管体内的蒸汽形成循环,所以反应液蒸发后的水汽不会在管盖上凝结。
市面上大家目前接触比较多的是可调式热盖,即热盖的高度可以手动调节,适用于各种PCR管,如高管和矮管。但是高度调节的压力是通过使用者来感觉的。
没压严实,导致热盖未发挥功能,反应体系减少,压得过头了,压力导致管体型变。
后来有了力矩式可调热盖
即热盖旋转到一定力矩后内置机构打滑,从而既保证了热盖压力,又防止了过度导致的变型。
但是还是需要注意的是,这类热盖使用结束后需要拧松热盖,否则下一个用户如果直接下压热盖,可能造成PCR管变型。
很多使用者会忘记松热盖。所以日常操作中不论是操作配置什么热盖的仪器,我们要养成习惯,除了使用后拧松热盖再取样本,同时在使用PCR仪器前习惯性地拧松热盖,预防上一位操作者未松热盖。
实际工作中,按照了以上良好的习惯去操作,为何还会出现管子变型的问题???
答 案
使用孔太少,压力不均导致的。以96孔为例,实验中,如果使用了16个以上的模块孔(具体的操作因人而异,同时也和放置的位置有关),实验的管子不会变型。
如果只用几个模块孔,反应的几个样本管,而且放在模块中央或者中央偏一点的位置,就很容易发生管子变型的情况。解决这一问题的办法其实也很好办。
如果这一批实验需要用到的模块孔很少,只有几个,那可以在模块孔zui边缘的四个角分别放4个空管(加不加水随意,目的只是为了平衡热盖下压的压力)。这样就可以解决扩增少量样本出现的管子变型的情况。
以上是对PCR实验中经常遇到的管子融化、变型问题的探讨,希望对您有帮助。