外泌体的分离多采用超速离心、磁珠免疫捕获、沉淀或过滤几种方法，这些方法仅适用于前期研究，对于后期工艺放大难以满足，限制了规模化生产药品级外泌体治疗产品供临床使用。致使有效的外泌体提取和外泌体纯化工艺技术成为外泌体治疗市场的一个关键技术阻碍。

鉴于外泌体的多种功能和再生潜力，获得高产量、高纯度和高质量的外泌体至关重要。目前，许多外泌体的分离技术都是基于它们的生物物理和/或生化特征，如大小、密度和特定表面标记而开发的。但是，由于要求的不同和生物流体的复杂性，必须仔细考虑分离技术的选择。

1、 超离心（UC）使用100,000 g的离心力来有效地分离小颗粒，如病毒、细菌和细胞器UC根据其主要作用机制大致可分为三类：差速离心(DC)、等密度梯度离心和速率带离心(RZC)。UC一直被认为是外泌体隔离的“黄金标准”。然而，每种生物流体的复杂性、特定组成和物理性质构成了获得可复制的纯外泌体制剂的技术障碍。

a、差速离心这项技术依赖于通过沉降沉淀法对颗粒进行顺序分离，这取决于颗粒的大小和密度，通过使用一系列离心力和持续时间。DC通过300至100,000 g的离心力进行多次离心循环，通过控制不同的离心力和离心次数，依次去除细胞、细胞碎片和凋亡小体。最后一次离心(即100,000 g)后，通过去除上清来收集外泌体。然而，差速离心法有一些局限性，例如耗时，需要昂贵的设备，操作繁琐，并且在过高的转速下破坏外泌体的完整性。此外，一些脂蛋白可以与外泌体共沉淀因此，我们提出了密度梯度离心法来提高外泌体的纯度。

b、使用两种类型的密度梯度超离心：等重超离心和RZC。DC经常遭受污染和外泌体损失，因为外泌体的不均匀性和细胞外囊泡大小有相当大的重叠。UC通常与等渗或RZC技术相结合，以允许相对低密度的外泌体悬浮以进一步净化。该技术还可以提高外泌体的分离量。典型的密度梯度UC包括以下步骤:首先，将覆盖样品颗粒密度范围的具有不同密度的生物相容性介质层(例如，碘二醇或蔗糖)放入管中，从底部到顶部密度逐渐降低。然后将感兴趣的样品添加到密度梯度介质的顶部，然后延长离心时间(例如，100,000 g离心16小时)。与普通UC相比，密度梯度离心可有效提高外泌体的纯度，例如，用密度梯度离心法从猪骨髓中分离骨髓细胞然而，蔗糖-密度梯度UC分离过程耗时长，需要大量的生物样品，回收率较低。Kuipers等人发现，对于小密度梯度的离心过程，碘沙醇比蔗糖更适合使用，因为在碘沙醇梯度中，外泌体可以以相对更快的速度达到平衡。因此，可以通过选择合适的惰性介质来优化外泌体的分离，从而提高分离效果。

1. 超滤UF是一种基于物质大小的分离方法，利用具有不同分子量截止点(MWCO)的膜分离外泌体，通常与其他方法联合使用进行进一步纯化。与UC相比，UF增加了囊泡隔离，显著缩短了处理时间，提高了吞吐量，但不需要特殊设备。但由于剪切力的作用，UF容易发生开裂和变形，造成外泌体的损失。

基于超滤原理，导出了切向流过滤和顺序过滤方法。在TFF模式下，样品流体沿平行于膜的方向进入，调节了膜间压力，减少了外泌体的损失和膜的堵塞，延长了膜的使用寿命。TFF在吞吐量、再现性、时间、成本和可扩展性方面都超过了UC。

2.顺序过滤是另一种常用的方法，其中样品首先通过1000 nm的过滤器去除细胞碎片和凋亡囊泡，然后通过500-kD MWCO的第二个过滤器去除TFF中的游离蛋白。最后，50 - 200nm直径的材料可以通过200nm的过滤器进行隔离。该方法具有温和、自动化、适合大颗粒的优点，可用于生产尺寸均匀的外泌体，在很大程度上保证了外泌体的完整性和纯度。

为了克服传统过滤的局限性，Chernyshev等人开发了不对称深度过滤(DF)，作为一种容易获得的方法，具有高收率和低外泌体污染。常规过滤一般分为表面过滤和DF过滤。

在表面过滤过程中，大颗粒由于其尺寸而被保留，这些颗粒最终会在过滤介质表面形成一个“饼”，而对于DF介质，大空隙允许颗粒进入介质的孔隙。因此，不对称DF方法的原理是，当外泌体固定在多孔介质表面和深度内时，小颗粒可以被洗脱。该方法适用于从用于培养ev分泌细胞的大量培养基中分离治疗性外泌体。

TunerSystems外泌体纯化系统 是一款研发型自动化过滤系统，理想的生物工艺开发研发阶段自动化切向流过滤系统，适合处理小体积的料液微滤和超滤，最高可处理量15L，循环体积可低至10mL。