WB过程中如何保证的蛋白转印
时间:2015-04-27 阅读:267
在WB过程中从SDS-PAGE胶上转移蛋白至膜上是非常关键的步骤!优化转移时间往往需要实验多次,下面就讲几条关于如何保证蛋白*转移的小技巧,适合新手参考:
使用预染的marker 预染marker不仅能够直观的观察到跑胶情况,而且在转移过程中也是很好的工具,在完成印迹后观察膜上的 marker ,看是否所有条带都已经转移至膜上。
在转印装置中加两块膜 小分子量的蛋白转移的比较快,而为保证大分子蛋白的转印,长时间的转印可能使小分子蛋白透过膜,因此,可以加入两块膜,如果能在第二块膜上检测到小分子蛋白,说明转印时间过长。
在转印后对胶染色 如果转印时间不够优化,通过对胶染色,在胶上能够观察到未转移*的蛋白,这种情况在转印大分子蛋白是常见,使用银染或者考马斯亮蓝的方法都可以。
二、Western blot转印的优化
从SDS凝胶中进行Western蛋白转印的优化需要对一系列参数进行考虑。目的是转印所有凝胶上的蛋白并将其定量地转移到转印膜上。进行转印需要一定程度的优化,尤其是对于大分子量和小分子量蛋白。
转印后,凝胶上应不残留或残留很少的蛋白。可以在转印后进行染色进行检测。转移出凝胶的蛋白应该仅在接触凝胶的膜的一面可见。如果有怀疑,在转印时使用第二个”支持膜”,你可以在转膜后染色,以检查是否有穿膜的迹象。如果发现蛋白残留在凝胶上而且膜的结合性很差,可以考虑下列因素:
SDS vs 甲醇
在多数转印实验步骤中都使用SDS和甲醇。但两者对于成功的转印有相反的作用,需要根据欲转印蛋白的性质加以优化。
SDS对于蛋白的迁移是必要的,尤其有助于大分子量蛋白从凝胶上的转移。但由于膜结合需要疏水相互作用,SDS过多会抑制结合,尤其对于硝酸纤维素膜。作为一个一般性的规则,如果膜的结合力有效,但蛋白仍旧残留在凝胶上,在转印缓冲液中加入 0.1%SDS会促进*转印。但另一方面,甲醇通过在蛋白上剥离SDS,促进蛋白和膜的疏水结合。一般在转印缓冲液中加入20%的甲醇会增加硝酸纤维素膜的结合能力。
凝胶浓度
丙烯酰胺浓度越低,蛋白越容易转移下来。选择可以分离蛋白的浓度zui低的凝胶。梯度胶适用于转印一系列不同大小的蛋白,因为凝胶的孔与不同大小的蛋白匹配良好。
凝胶厚度
蛋白比较易于从薄胶上转移下来,所以如果上样体积允许,使用1.0mm厚的胶取代1.5mm的胶。
电场(电压×时间)
如果电压过低而且转印时间过短,部分蛋白会残留在凝胶上。如果电压过高,小蛋白会在结合到膜上前透膜而出。如果按建议的条件转印后有蛋白残留在胶上,增加电压可能会有帮助,但不要超过5V。
膜的类型
蛋白结合到硝酸纤维素膜上主要通过疏水键。PVDF膜比硝酸纤维素膜更疏水,在转印过程中结合蛋白更紧密,可以耐受更多的SDS。目前,PVDF膜一般比硝酸纤维素膜需要更严谨的封闭条件,其适用于蛋白印迹。尼龙膜通过疏水和静电相互作用结合,其SDS耐受度甚至高于PVDF膜,但也需要更严谨的封闭条件,主要建议用于Northern和 Southern。