抗体快速发现—基于CFPS的高通量抗体筛选方案
时间：2024-10-25 阅读：93
小鼠杂交瘤技术生产单克隆抗体（mAb）具有耗时长、局限于特定动物物种的缺点，另外，B细胞和骨髓瘤伴侣的融合效率低限制了单克隆抗体的复现机会。而噬菌体、酵母、哺乳动物细胞展示技术中，亲本文库是通过重链和轻链基因的随机组合构建的，免疫反应中一些体内重链和轻链库会丢失，非自然可变区对无法有效结合，导致可用的抗体很少。这些技术方案的瓶颈，制约了抗体筛选研究的发展。
单B细胞+CFPS高通量筛选方案
单B细胞筛选技术可以利用免疫动物的单个B细胞快速生成mAb，是获得天然抗体库的有力技术。其中，mAb的重组生产通常是用动物细胞（如CHO和HEK 293）瞬时表达系统进行的，而动物细胞中的转染和表达至少需要3~5天，这极大限制限制了抗体筛选速度。
无细胞蛋白表达（CFPS）为mAb表达提供了一种新方式。该技术通过将细胞内的RNA聚合酶、核糖体及转录翻译辅助因子等合成蛋白所需要的分子机器提取出来，并辅以核苷酸、氨基酸、能量物质及基因模板，在没有活细胞参与的体外直接合成蛋白质。
CFPS在高通量重组蛋白表达方面相比体内表达方法具有显著优势：
1
CFPS无需基因克隆、转染、细胞培养、细胞裂解，流程简单、表达快速；
2
CFPS允许高通量表达，且便于实现自动化，可适配高通量移液工作站进行高通量、自动化抗体表达，更节省人力成本；
3
CFPS开放性、可控性强，允许添加辅助蛋白折叠的酶，促进抗体上清可溶表达。
图1 哺乳动物细胞表达筛选与CFPS高通量筛选流程示意图
单B细胞+CFPS高通量筛选案例
目前，已有报道通过单B细胞建立抗体库以及CFPS表达mAb的筛选方案，在2天内完成了抗原特异性mAb的筛选。该方案包括从免疫兔的外周血中收集B细胞、通过抗原包被的磁珠和内质网(ER)染色选择B细胞、基于单细胞的PCR、在CFPS中生产mAb以及CFPS产物直接进行ELISA实验。
图2 利用CFPS从单B细胞中快速筛选单克隆抗体的Ecobody技术
（一）B细胞筛选与分离
研究人员从用灭活副溶血性弧菌免疫的兔子的几毫升血液中采集6.8×106个淋巴细胞，用ER追踪器对细胞进行染色，并通过荧光激活细胞分选（FACS）收集到约2.0×104个细胞显示强荧光的细胞。随后，将涂有灭活副溶血性弧菌的磁珠加入细胞混合物中，用磁铁分离与抗原结合的约500个细胞，其中19个用于单细胞PCR。每10µL分离一个细胞到384孔板中，并在倒置相差显微镜下选择和确认细胞-磁珠复合物。
（二）单细胞RT-PCR
使用基因特异性引物和SuperScript IV逆转录酶进行逆转录。第一次 PCR使用与信号肽(SP)序列和抗体基因恒定区退火的引物，第二次 PCR使用带有后续Gibson组装步骤所需尾巴的引物。
以上环节在第一天完成。
（三）构建CFPS模板与CFPS反应
通过Gibson组装将T7启动子和终止子与抗体基因结合，然后通过PCR扩增DNA片段，用于无细胞蛋白合成。
为了增强Hc和Lc的正确配对，研究人员还开发了一种名为“Zipbody”的改良Fab形式。即设计亮氨酸拉链(LZ) LZA和LZB，分别融合在Hc和Lc的C端。此外，还在N端添加短肽序列标签Ser-Lys-Ile-Lys(SKIK)，以提高蛋白表达水平。
随后，使用DsbC和氧化谷胱甘肽（GSSG）通过CFPS表达带有SKIK标签的Zipbody。
（四）ELISA实验
首先通过SDS-PAGE的荧光成像确认了这些基因的蛋白质表达。然后，CFPS产物直接进行ELISA实验。所有以 Zipbody形式表达并包含 SKIK 标签的克隆对副溶血性弧菌的结合活性均高于对其他测试抗原（大肠杆菌 O157、O26、O111或BSA）的结合活性（图 3a）。
图3 Ecobody技术获得的mAb的ELISA评估
（五）案例总结
该方法不需要将DNA转染到活细胞中，也不需要细胞培养来进行体内蛋白质表达，只需将大肠杆菌细胞提取物与模板DNA（PCR片段）、氨基酸、核苷酸、T7 RNA聚合酶和能量源混合，即可在60至90分钟内获得mAb，整个筛选过程比使用动物细胞表达的方法显著简化。此外，通过比较纯化蛋白的WB和ELISA信号的条带强度，该实验10 μL CFPS体系中mAb平均产量约为0.3 μg，即30 μg/mL。CFPS中mAb的表达量足够通过ELISA进行筛选，从而使过去可能因表达量不足被认为活性低而被忽略的阳性克隆可以得到合理的评估。
珀罗汀生物CFPS抗体表达
珀罗汀生物自主知识产权的无细胞蛋白表达（CFPS）系统支持多条肽链的自主组装，可实现VHH、scFv等抗体分子以及全长抗体IgG的上清可溶表达。已有ELISA实验结果表明，珀罗汀生物CFPS系统表达的抗体具备高免疫活性。
珀罗汀生物CFPS抗体表达案例一
图4 某IgG与Fab片段SDS-PAGE图及其ELISA活性（CFPS）
珀罗汀生物CFPS抗体表达案例二
图5 某两个VHH（左）与scFv（右）的SDS-PAGE图（CFPS）