Co-IP（免疫共沉淀，co-inmunoprecipitation）是经典的利用抗体从样品中捕获靶蛋白及其互作蛋白、复合体的一项技术，能够特异性富集所研究的目的蛋白。

免疫共沉淀Co-IP实验步骤

细胞转染

1.铺细胞，转染细胞。本次转染的两个蛋白分别带有FLAG和HA标签。

裂解细胞

2.去除培养基，PBS吹下细胞，离心去上清。将细胞沉淀转移到1.5mlEP管中，PBS洗，离心去上清，加1ml裂解液。

3.冰上孵育40min，每10min震荡一次。

4.超声破碎细胞结构和打断染色质。冰上操作。

这个功率和时间要你自己摸索，不同细胞不同机器都会有差别，一般的国产机器对10^7细胞用20%功率超声4分钟左右即可比较充分（超声2秒，停2秒）。直到溶液相对比较清澈，没有丝状DNA。

5. 4度，12000 rpm/min离心10mins。

6.转移上清(上清体积会有所增加，可能是因为细胞溶解了)到新的预冷的试管中。取50ul上清作为input。

7.将剩余样品分为两份,其中一份加入FLAG(MOUSE)抗体1uL（转染的蛋白带有FLAG标签），一份加入相应宿主的普通IgG(mouse),4℃轻摇过夜，使抗体和目标蛋白充分结合。

抗体与beads的结合

8.将beads吸出至新管（每个107样品准备40ul beads悬液，约含20ul Protein A/G beads，细胞较少时可适当减少，最少10ul悬液否则后续操作会很困难）用2倍体积(PBS+0.1%triton-100)洗涤3次，去上清。3000rpm离心1min基本可以充分沉淀，转速时间可调。

9.用等体积的buffer重悬beads。

10.在每个样品中加入20ul beads悬液，4℃轻摇2小时，使抗体和beads充分结合。

样品的收集和洗涤

11.将IP过后的样品离心 3000rpm 1min。

12.将上清转移至新管 标记为Flow through。

13.加入500ul (PBS+0.1%triton-100)洗涤beads 4℃轻摇5min  3000rpm 1min 弃上清。

14.洗涤三次，最后一次尽量去除上清。

样品的洗脱

15.用30-100ul裂解液重悬beads，具体体积根据SDS-PAGE需求自定。

16.将样品和input中加入合适体积的loading buffer混匀，必要时可以将Flow through进行制样检测。

17.95℃-100℃热变性10-15min，冷却后冻存备用。

18.SDS-PAGE和WB检测。IP用的是FLAG抗体，检测HA。

关于免疫共沉淀Co-IP实验步骤，你还有什么疑问吗？