Western Blot 实验，也叫蛋白质免疫印迹实验，主要用于检测和分析样品中的特定蛋白质。该技术涉及将蛋白质样品通过凝胶电泳分离，然后转移到膜上，通常使用硝酸纤维素或聚偏氟乙烯膜。转移后，膜上的蛋白质与特异性抗体结合，这些抗体可以识别目标蛋白。通过使用标记的二抗，可以检测出与目标蛋白结合的抗体。最后，通过化学发光、荧光或放射性标记等方法来可视化目标蛋白。Western Blot实验广泛应用于生物学和医学研究中，用于蛋白质表达分析、疾病标志物的检测以及信号传导途径的研究。具体实验细节，请一起阅读本篇文章，来了解一下Western Blot实验操作的全流程吧！

1. 蛋白提取：

①　准备工作：收集细胞或研磨组织（对于细胞，可先去除培养液，用预冷的 PBS 清洗；对于组织，可采用液氮研磨或匀浆器处理）。

②　裂解细胞 / 组织：加入适量的裂解液（通常已添加蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解），比如每 106 个细胞中加入 100μl 裂解液。裂解液的体积需根据组织总量来决定，要确保蛋白提取物不会过于稀释，以减少蛋白质损失。将细胞或组织与裂解液充分混合，在低温（如 4℃）下持续振荡 15-30 分钟，期间为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动。

③　超声处理或抽打：冰上超声处理，一般使用 20-30% 功率，超声 1-2 分钟，目的是断裂 DNA，使蛋白更好地释放；也可以使用 1ml 注射器进行抽打，达到类似效果。

④　离心：低温下以最高转速离心 20 分钟，上清液即为所需的蛋白样本，将其收集到新的离心管中备用。

2. 蛋白定量：

①　蛋白标准品稀释：用蛋白裂解液配制一系列浓度梯度的蛋白标准品。

②　加样：取 20μl 不同浓度蛋白标准品和 20μl 蛋白样品（如果样品显色过深，需要提前稀释）加到 96 孔板中，蛋白标准品和每个样品最好设置三个技术重复。

③　配制 BCA 工作液并加样：根据待测孔数量，按 A 液：B 液 = 50:1 配制适量 BCA 工作液，充分混匀后加入 96 孔板中，每孔 200μl。

④　孵育与检测：将 96 孔板在 37℃放置 20-30 分钟（也可以室温放置 2 小时，或 60℃放置 30 分钟），反应结束后，用酶标仪测定 96 孔板在 562nm 处的吸光值。

⑤　计算蛋白浓度：根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。蛋白浓度测好后，加入 Loading Buffer 变性蛋白，准备上样跑胶。

3. 制胶：

①　组装制胶装置：将玻璃板卡在制胶架上，底部与海绵胶条贴紧，注意提前检查是否漏液。

②　配制分离胶：按照配方配制所需浓度的分离胶，注意 TEMED 要最后添加，充分混匀后，用移液枪小心地将分离胶溶液灌入组装好的玻璃板中，枪头要紧贴玻璃板内壁。

③　液封分离胶：在分离胶表面轻缓地覆盖一层 ddH2O，使分离胶表面平整，室温静置凝固约 30-60 分钟（天气冷时凝胶时间需延长，建议提前配胶）。

④　处理分离胶：待分离胶充分凝固后，小心倾斜或倒置弃去分离胶上层的 ddH2O，用洁净的滤纸伸入玻璃板吸走剩余的 ddH2O（注意滤纸不要触碰到分离胶）。

⑤　配制浓缩胶：使用浓缩胶配方配制浓缩胶，同样 TEMED 最后添加，充分混匀。

⑥　灌制浓缩胶：立即将浓缩胶溶液用移液枪小心地灌入分离胶上层，插入点样梳，确保凝胶中或梳齿周围没有气泡，让凝胶在室温下凝固约 30-60 分钟。

4. 电泳：

①　安装凝胶：将准备好的凝胶夹在电泳芯中，放置到电泳槽中，往槽中加入电泳液，如果同时跑两块胶，则液面达到下方刻度线，如果跑四块胶，则液面需要到达上方刻度线，内槽中电泳液需加满至溢出（若整个电泳槽未加满，开跑后需注意中间是否会漏液）。

②　上样：缓慢垂直向上拔出点样梳，上样前将上样孔中的气泡赶尽（若有），使用特定的凝胶上样枪头或 10μl 的枪头往上样孔中缓慢加入前期制备好的样品。

③　设置电泳条件：盖上电泳槽，开启电源进行电泳（注意电极连接正确），浓缩胶的电压通常为 80V，分离胶的电压通常为 120V，电泳时间通常为 1 小时左右，但具体参数可根据目标蛋白的分子量进行相应调整。

④　结束电泳：当染料分子溴酚蓝到达凝胶的底部时，关闭电源。此时蛋白会开始缓慢弥散，因此要迅速进行下一步操作。

5. 转膜：

①　配置转膜缓冲液：转膜缓冲液最好配成母液，现配现用。

②　活化 PVDF 膜：PVDF 膜使用前需在甲醇中活化。

③　切胶与平衡：用 ddH2O 冲洗胶块后切除浓缩胶和溴酚蓝，在转膜缓冲液中平衡 3-5 分钟，留下含有目的蛋白的凝胶。

④　构建 “转膜三明治”：从负极到正极依次是海绵、滤纸、凝胶、PVDF 膜、滤纸、海绵，注意 PVDF 膜贴合凝胶时，避免产生气泡。

⑤　转膜：常见的转膜条件是 100V，1-2 小时（电压和时间可以根据蛋白分子量大小进行调整）。转膜结束后，可以用丽春红染色判断膜上是否有蛋白，这种方法可逆无毒，耗时短。

6. 封闭：

①　配置封闭液：转膜结束前 30min，以 TBST 为缓冲体系配置封闭液，并利用涡旋仪、摇床等仪器使封闭液充分溶解并混匀。

②　孵育：转膜结束后，在抗体孵育盒中加入适量封闭液，用镊子夹住膜，将其wan全浸泡在封闭液中，置于摇床上室温低速摇动孵育 1-2 小时，也可以 4℃冰箱孵育过夜。

7. 一抗 / 二抗孵育：

①　一抗孵育：根据抗体说明书稀释一抗，封闭液可作为抗体稀释液，也可使用 1×TBST 稀释一抗。将膜浸泡在稀释好的一抗中，保持适当的摇动使之均匀覆盖，常见的一抗孵育条件为室温 1.5-2 小时或 4℃过夜。

②　洗膜：一抗孵育结束后，用洗膜液（如 PBST 或 TBST，后者效果更好）洗去未结合的抗体，建议清洗 30 分钟，或 10 分钟 3 次 / 6 分钟 5 次。

③　二抗孵育：参考一抗步骤稀释二抗，将膜浸泡在二抗中，室温孵育 45 分钟 - 1 小时。

8. 免疫检测：

①　洗膜：二抗孵育完毕后，回收二抗，用 TBST 洗膜，洗去未结合的二抗。

②　显影：将发光液敷在膜上，通过化学发光成像仪曝光，采集图像并使用 ImageJ 等软件分析灰度值。