超敏ECL化学发光试剂盒的应用

用于阻断肾上腺素能受体对人内皮细胞体外血管生成的影响研究

    普萘洛尔、酚妥拉明抑制人微血管内皮细胞体外血管生成目的研究离体情况下,p-AR阻断剂普萘洛尔、a-AR阻断剂酚妥拉明对人微血管内皮细胞增殖、迁移、成管及VEGF、VEGFR-2、Ang1、Ang2、Tie-2表达的影响。

    方法1.细胞免疫荧光鉴定内皮细胞：细胞采用免疫荧光染色Ⅷ因子进行鉴定。将人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞接种于24孔板爬片。待细胞融合至80%-90%时,4%冰多聚甲醛固定20分钟,0.2%Triton X-100通透10分钟,羊血清封闭30分钟。兔多克隆Ⅷ因子（vWF）一抗4℃湿盒内过夜。TRITC标记的羊抗兔二抗室温孵育2小时（避光）。Hochest（1μg/ml）染核15分钟（避光）后10%甘油封片。正置荧光显微镜下观察、拍片（×200倍）。

    2. Western blot检测人微血管内皮细胞a-AR的表达：未经药物处理的人皮肤微血管内皮细胞和人脑微血管内皮细胞经裂解获得总蛋白。BCA定量,沸水灭活。取总蛋白约40μg进行SDS-PAGE凝胶电泳后,转移到PVDF膜上。5%BSA封闭1小时,蛋白样品分别在4℃冰箱孵育兔多克隆抗α1-AR、α2-AR一抗过夜。次日在37℃孵箱中孵育相应的二抗1h。采用超敏ECL化学发光试剂盒显色,于暗室内压片,显影定影。

    3.细胞增殖实验：将人皮肤微血管内皮细胞种植于96孔板,将不同浓度梯度的普萘洛尔（0,25,50,75,100μM）、酚妥拉明（0,10,30,50,70μg/ml）分别处理细胞48h。然后每孔加入10μlCCK-8,孵箱中继续培养2h。之后于酶标仪测450nm下吸光度值。