口蹄疫O型抗体检测试剂盒（酶联免疫法）检测原理
时间：2024-11-11 阅读：44
口蹄疫O型抗体检测试剂盒（酶联免疫法）
使用说明书
【产品名称】
通用名：口蹄疫O型抗体检测试剂盒（酶联免疫法）
英文名：Test Kit for Antibodies to Foot and Mouth Disease Virus Asia O（ELISA）
【包装规格】 96T×1/盒、96T×2/盒、96T×5/盒
【预期用途】 口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，其特征为口腔黏膜、蹄部、乳房皮肤发生水泡和烂斑。
本试剂用于检测牛、羊、猪血清中口蹄疫O型抗体，可用于口蹄疫O型疫苗免疫效果评价。
【原 理】
本试剂盒由预包被口蹄疫O型抗体的酶标板、抗体工作液、抗原液、酶标记物及其他配套试剂组成，应用阻断酶联免疫法（ELISA）原理检测牛、羊、猪血清样本中口蹄疫O型抗体。实验时将稀释的样本与抗原液同时加入酶标板中孵育，样本中的抗体与酶标板上的抗体竞争抗原，阻断抗原与板的结合；经洗涤后，再加抗体工作液孵育；经洗涤后加入酶标记物孵育；再经洗涤除去未结合的酶标记物，在孔中加底物液，与酶标结合物反应形成蓝色产物，显色深浅与样品中的特异性抗体含量成负相关；加入终止液终止反应后，产物变为黄色；用酶标仪在450nm波长测定各反应孔中的吸光值，即可知样品是否含有口蹄疫O型抗体。
【试剂盒组成】
序号 | 名称 | 规格/96T×1 | 规格/96T×2 | 规格/96T×5 |
1 | 酶标记物 | 6ml×1(红盖) | 11ml×1(红盖) | 26ml×1(红盖) |
2 | 抗体工作液 | 6ml×1(蓝盖) | 11ml×1(蓝盖) | 26ml×1(蓝盖) |
3 | 抗原液 | 6ml×1(黑盖) | 11ml×1(黑盖) | 26ml×1(黑盖) |
4 | 20X浓缩洗涤液 | 40ml×1(白盖) | 40ml×2(白盖) | 200ml×1(透明) |
5 | 底物液A | 6ml×1(白盖) | 11ml×1(白盖) | 26ml×1(白盖) |
6 | 底物液B | 6ml×1(黑盖) | 11ml×1(棕盖) | 26ml×1(黑盖) |
7 | 终止液 | 6ml×1(黄盖) | 11ml×1(黄盖) | 26ml×1(黄盖) |
8 | 阳性对照 | 1.0 ml×1(红盖) | 1.5 ml×1(红盖) | 2.0 ml×1(红盖) |
9 | 阴性对照 | 1.0 ml×1(绿盖) | 1.5 ml×1(绿盖) | 2.0 ml×1(绿盖) |
10 | 酶标板 | 96T×1 | 96T×2 | 96T×5 |
11 | 盖板膜 | 1 | 2 | 5 |
12 | 自封袋 | 1 | 1 | 2 |
13 | 说明书 | 1 | 1 | 1 |
14 | 稀释板 | 1 | 2 | 5 |
【储存及有效期】 2～8℃保存，有效期12个月。
包被板开封后请于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限为2个月。
【适用仪器】 含450nm、630nm波长的酶标仪，37℃恒温设备，可调微量移液器。
【样品准备】
1.取动物全血按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血、无污染。样品1周内可于2～8℃保存，长期需置-20℃保存。
2.用工作洗涤液将待检牛、羊血清先按32倍稀释（如5μl血清加入155μl工作洗涤液中，混匀），待检猪血清按16倍稀释（如5μl血清加入75μl洗涤液中，混匀），阴、阳性对照不用稀释。
3.浓缩洗涤液使用前应恢复至室温使沉淀溶解，然后用蒸馏水或去离子水作20倍稀释成工作洗涤液(如19份蒸馏水或去离子水+1份浓缩洗涤液)。
【检验方法】
1.使用前将试剂盒置室温30分钟，恢复至室温。
2.取所需用量酶标板条，设阴性/阳性对照各2孔，未用的板条尽快密封，2～8℃保存。
3.阴、阳性对照孔分别加入阴、阳性对照50μl，样品孔每孔先加入工作洗涤液25μl，再加入稀释后的样品25μl；最后都加入抗原液50μl。
注：加入抗原后牛、羊样本稀释比例相当于1:128，猪样本稀释比例相当于1:64。
4.震荡混匀10秒，盖好盖板膜，置37℃（推荐水浴）避光反应30分钟。
5.甩去孔内液体，每孔加350μl工作洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，最后一次拍干。
6.每孔加抗体工作液50μl，盖好盖板膜，置37℃避光反应30分钟。
7.洗涤，同步骤5。
8.每孔加酶标记物50μl，盖好盖板膜，置37℃避光反应30分钟。
9.洗涤，同步骤5。
10.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混匀，盖好盖板膜，置37℃避光反应15分钟
11.每孔加终止液50μl，混匀，于450nm(可用630nm作参比波长）测定各孔吸光值（A值）。
【参考值】 实验正常的情况下，阴性对照A值≥0.8，阳性对照A值≤50%×阴性对照A值。
【检验结果的解释】
1.PI（阻断率）=（1- 阴性对照平均A值）×100%，PI≥50%为阳性；PI＜50%为阴性。
2.本实验检测牛、羊血清结果为阳性时表明待检样本中含有口蹄疫O型抗体，且效价高于1:128，达到保护水平；反之检测结果为阴性时表明待检样本中不含有口蹄疫O型抗体，或效价低于1:128，未达到充足保护水平。
3.本实验检测猪血清结果为阳性时表明待检样本中含有口蹄疫O型抗体，且效价高于1:64，达到保护水平；反之检测结果为阴性时表明待检样本中不含有口蹄疫O型抗体，或效价低于1:64，未达到充足保护水平。
4.如需了解样本抗体的最终效价，可将样本进行梯度稀释，使PI≥50%的最高稀释比例即为该样本抗体的最终效价。
【试验方法的局限性】
该试验仅作为定性牛、羊、猪血清中口蹄疫O型抗体，根据PI值高低可作抗体水平强、中、弱的粗略评估。
该试剂盒不适用于合成肽疫苗免疫抗体效价评估。
【注意事项】
1.实验操作时需戴手套、穿工作衣，严格健全和执行消毒隔离制度，各种实验废弃物都应按传染物处理。
2.终止液具有腐蚀性，应避免接触皮肤和衣物，如不慎接触请立即用大量自来水冲洗。
3.酶标板从冷藏环境中取出时应恢复至室温方可开袋，未用完的酶标板需放入有干燥剂的密封袋中保存。
4.浓缩洗涤液在低温时容易结晶，使用时需恢复至室温溶解。
5.洗涤时各孔均需加满液体，防止孔口有游离酶不能洗净。
6.用于检测的样品应保持新鲜。
7.试验结果的判定必须以酶标仪读数为准。
8.不同批号试剂组分不得混用。