Chromatrap ChIP相关试剂盒

Chromatrap公司技术领域。

Chromatrap为Porvair Science公司旗下的产品。该品牌产品主要为ChIP相关试剂盒。Chromatrap® ChIP 测定技术比传统磁珠法的效率更高，原因是与蛋白质 A 或 G结合的固相多孔聚合物捕获染色质的效率更高。尽管同样是使用离心柱法，但其优势是琼脂糖珠或磁珠远不可相比的

介绍

在转录过程中，新生RNA可以与DNA模板链杂交，使非模板DNA链成为单链。这些结构被称为 R 环，它们的持续形成会对基因组完整性造成有害影响，这可能是由于未配对的单链 DNA （ssDNA）

尽管R环有可能在基因组的很大一部分上形成，但它们并不是转录的简单结果。由于 DNA 序列、转录、拓扑和染色质环境的复杂相互作用，它们发生在特定的保守位点上 （切丹， 2016）。在具有未甲基化 CpG 岛启动子的活性哺乳动物蛋白质编码基因上，R 环富集在启动子和终止位点上并增强激活，并且它们与活性转录的组蛋白标记相关，例如组蛋白 H3 赖氨酸 4 的单甲基化和三甲基化 （H3K4me1/3） 和 H3 乙酰化.R-loops可以作为转录激活因子，但它们也可以通过各种机制诱导不同细胞类型的转录抑制.R环在激活或抑制中的这种“双重”功能强烈表明，R环的形成在不同的情况下可以具有不同的作用和机制。

Polycomb 组（PcG） 蛋白是转录抑制的主要表观遗传调节因子，它们需要沉默胚胎干细胞 （ESC） 中富含 CpG 的发育调节基因，并维持在细胞承诺期间建立的基因表达模式 它们组装在两个主要的多亚基复合物中：Polycomb 抑制复合物 1 （PRC1） 和 PRC2。PRC1 和 PRC2 的催化组分分别为 RING1B 和 EZH2。RING1B 单泛素化赖氨酸 119 （H2Aub1） 中的组蛋白 H2A，EZH2 是一种甲基转移酶，负责赖氨酸 27 （H3K27me2/3） 中 H3 的二甲基化和三甲基化。

Polycomb介导的转录抑制机制尚不wan全清楚。尽管它们在抑制中起作用，但小鼠胚胎干细胞 （mESC） 中的 PcG 靶基因显示活性染色质标记 H3K4me3、RNA 聚合酶 II （Pol II） 和一般转录因子。Pol II 在 PcG 抑制基因的启动子和编码区上检测到，并表现出其 C 末端结构域 （CTD） 的丝氨酸 5 磷酸化 （Ser5P），但不表现出 Ser2P 或 Ser7P，后者是生产性转录延伸的标志物.与沉稳的Pol II的存在一致，在一些PcG靶标

例如，转录本身起着一定的作用，因为仅基因沉默就可以促进PRC2募集到CpG岛启动子.建议通过PRC2（Wang 等人，2004,Boyer 等人，2006 年）。然而，非经典 PRC1（含有 RYBP 而不是 CBX）也可以通过 KDM2B 赖氨酸去甲基化酶

迄今为止，已经在人类 ESC 中探索了 PcG 靶基因上 R 环的存在，其中基于生物信息学分析检测到正相关 （Ginno 等人2013 年），在分化的小鼠成纤维细胞（NIH 3T3 系）中，报告了负相关 （Sanz 等人，2016 年).因此，目前尚不清楚PcG抑制机制是否以及如何受到R环的调节。

在这里，我们使用 mESC 来探索 R 环对 PcG 抑制机制的贡献。我们发现 R 环在 PcG 靶标处形成，R 环丢失导致 PcG 募集不足和 Pol II 的镇定状态改变，导致基因去抑制。全基因组分析表明，R环的形成不是低转录水平的微不足道的结果，并且仅发生在PcG抑制基因的一个子集上。单独敲除组成型 EZH2 （PRC2） 不足以影响 R 环或 RING1B （PRC1） 募集，也不会导致 R 环阳性基因的转录去抑制。相反，在这些情况下去除 R 环会导致基因激活并减少 RING1B 募集。在抑制 EZH2 催化活性后，R 环和 RING1B 可以抑制 PcG 靶标。我们的研究结果揭示了 R 环和 PRC1 募集之间意想不到的相互作用，这有助于 PcG 抑制。

结果

R-环在 PcG 抑制基因上形成为了研究 R 环是否在 PcG 介导的转录沉默中发挥作用，我们使用 DNA-RNA 免疫沉淀（DIP 或 DRIP）分析 （Skourti-Stathaki 等人，2011 年,Ginno 等人，2012 年,Ginno 等人，2013 年,Skourti-Stathaki 等人，2014 年,Sanz 等人，2016 年） 在 mESC 中。我们选择了五个先前表征的基因，即 Msx1、Math1、Nkx2.2、Nkx2.9 和 Gata4。这些基因具有注释良好的 CpG 岛启动子，在其启动子和编码区富含 GC，并且在 mESC 中由 PRC1、PRC2 和稳固的 Ser5P Pol II （Stock 等人，2007 年,Brookes 等人，2012 年,Ferrai 等人，2017 年).用 RNA-DNA 杂交特异性抗体 S9.6 （Boguslawski 等人，1986 年），并使用位于含有转录起始位点 （TSS） 的启动子 （P） 区域和基因体编码 （C） 区域内的引物分析纯化的 DNA。作为阳性对照，我们使用了高表达的活性基因 β-肌动蛋白，它在 P 和 C 区域形成 R 环 （Skourti-Stathaki 等人，2011年,Skourti-Stathaki 等人，2014 年).作为阴性对照，我们使用不形成 R 环的活性基因 CyclinB1（Skourti-Stathaki 等人，2014 年）和在mESC中既不表达也不与PcG或Pol II相关的基因Myf5（Stock 等人，2007 年,Brookes 等人，2012 年).正如预期的那样，R-环在β-肌动蛋白上富集，但在CyclinB1或Myf5上未检测到。值得注意的是，在所有五个 PcG 抑制基因的 P 和 C 区域，R 环都特异性富集。

以下为Chromatrap公司热销产品