1、适用范围

本方法适用于清汁、浊汁、水和浓缩果汁中的耐酸耐热菌的检测。

2、仪器和试剂

2.1 恒温水浴：80±1℃。

2.2 恒温培养箱：40±1℃。

2.3 灭菌培养皿：直径为90mm。

2.4 灭菌试管：18×180mm。

2.5 滤膜：0.45um水系一次性滤膜。

2.6 酵母粉。

2.7 蛋白胨。

2.8 琼脂粉。

2.9 葡萄糖。

2.10 吐温80。

2.11 12.5%苹果酸。

2.12 灭菌蒸馏水。

2.13 K氏培养基平板：在1000ml的三角瓶中放入500ml蒸馏水，加入1.25g酵母粉、2.50g蛋白胨、6.50g琼脂粉、0.5g 葡萄糖和0.5ml吐温80，使其溶解，轻轻盖上三角瓶的盖子，在121℃灭菌25分钟；在一个小烧杯中加入10ml蒸馏水和1.25克的苹果酸，搅拌直至溶解，将苹果酸的水溶液用0.45um的滤膜过滤，将处理过的苹果酸水溶液加入到灭菌的K氏培养基中，搅拌均匀，使其pH值达到3.7±0.1。当冷却到大约50℃时，将K氏培养基倾注到培养皿中，凝固后在0-5℃的冰箱中储存，有效期60天，并记录配制日期。

3、操作步骤

3.1 样品处理

3.1.1 浓缩清汁：

打开水浴锅，调整温度到80±1℃。以无菌操作，取10ml浓缩清汁于15ml灭菌的试管中，再移取10ml浓缩清汁于另一带有温度计的15mL的试管中，作为温度控制用，盖上样品试管的盖子。将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中，当温度达到80±1℃，开始计时，维持13分钟（用计时器计时）。冷却至室温，用90-100ml的灭菌蒸馏水将热处理过的样品转入灭菌容器中，摇匀。将稀释后的样品溶液用0.45um的滤膜真空过滤。

3.1.2 清汁、水：

打开水浴锅，调整温度到80±1℃。以无菌操作，取150ml清汁（或水）于已灭过菌的玻璃样品瓶中，再移取150ml清汁（或水）于另一带有温度计的玻璃样品瓶中，作为温度控制用，盖上样品瓶的盖子。将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中，当温度达到80±1℃，开始计时，维持13分钟（用计时器计时）。将热处理过的样品冷却至室温，用0.45um的滤膜真空过滤。

3.1.3 浊汁：

打开水浴锅，调整温度到80±1℃。以无菌操作,取20ml浊汁于已灭过菌的试管中,再移取20ml浊汁于另一带有温度计的20mL的试管中，作为温度控制用，盖上样品试管的盖子。将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中,当温度达到80±1℃时,开始计时，维持13分钟（用计时器计时）。冷却至室温，将热处理的样品用0.45um的滤膜真空过滤。

3.2 培养及计数

取掉过滤器的上部装置，用灭菌的镊子，将过滤膜从过滤器上取下放在K氏培养基上，轻敲数次，以保证滤膜与培养基接触。倒置于40-41℃恒温培养箱中，在恒温培养箱底部放置一个有水的盘子，以调整恒温培养箱的湿度，培养5天。培养结束后，记录该培养温度下滤膜上的菌落数。

根据对样品的污染情况，可选择稀释度。用灭菌吸管吸取25ml样品，加入到225ml灭菌蒸馏水中，做成1：10的稀释度；用灭菌吸管吸取1：10的稀释液25ml，加入到225ml灭菌蒸馏水中，做成1：100的稀释度，稀释后的样品的检测方法同上。培养结束后，记录滤膜上的菌落数，并按相应的稀释度进行计算。

4、数据处理

结果报告10ml的浓缩清汁样品中含有的菌落数,报告单位为cfu/10ml。

结果报告150ml的清汁（或水）样品中含有的菌落数，报告单位为cfu/150ml。

结果报告20ml的浊汁样品中含有的菌落数，报告单位为cfu/20ml。