DNA不仅存储遗传序列信息，同时还有表观修饰信息，这两者都对我们理解生物学至关重要。通过高通量测序测定DNA碱基G、C、T和A序列的方法已经比较成熟，近年来针对DNA中的表观遗传信息的检测方法也有了很大的进展，比如通过碱基转换的方法区分未修饰的C与修饰的5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。这些方法包括基于亚硫酸氢盐的方法，如全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)和无亚硫酸氢盐方法，如酶甲基测序(EM-seq)和TET辅助的吡啶硼烷测序等。但是目前的DNA测序方法大多数只能解决序列信息或表观修饰信息中的一种，缺乏将两者同时测定的方法，因此最终获取的DNA信息均布完整。尽管其中一些方法可以通过独立操作、并行建库等工作流程和测序来获得完整的信息，但是这可能会增加样本需求、成本和时间。此外，合并不同的数据库也很困难，会导致额外的测量误差和信息覆盖缺失。
 

　　为了解决DNA测序过程中序列信息和表观信息的统一性，2023年2月6日，来自剑桥大学的Shankar Balasubramanian和来自剑桥Epigenetix公司的Joanna D. Holbrook合作在Nature Biotechnology上以Article形式发表了题为Simultaneous sequencing of genetic and epigenetic bases in DNA的文章，提出了一种可以同时在一个样品中检测DNA序列信息和表观修饰信息的方法。
 

　　研究人员首先开发了一种Five-letter seq的方法(如下图)，该方法不仅可以读取常规G、C、T和A序列，同时还能读取包含修饰胞嘧啶信息(包含5mC和5hmC)。该方法的原理是创造性地使用了双碱基编码系统，通过两种碱基的组合解码一种序列或修饰信息，这个系统最多可以对多达16个状态的DNA进行明确的解码。具体地操作流程如下：样本DNA首先通过超声破碎，然后在两端连接上短的DNA发夹序列形成哑铃状DNA。然后，哑铃状DNA被拆分成单链，通过DNA聚合酶3'端延伸作用合成互补链，此时互补链是没有表观遗传修饰的，而原始样本DNA链与其互补链连接形成新的发夹结构。然后将测序接头连接到发夹结构DNA的末端。接下来利用TET甲基胞嘧啶双加氧酶2将5mC氧化为5hmC或5fC或5caC，然后通过β-糖基转移酶将所有5hmC进行糖基化反应，经过这样处理之后ModCs(5mC和5hmC)被保护起来不能进行脱氨反应。未受保护的C通过APOBEC3A胞嘧啶脱氨酶(A3A)作用被脱氨转变为尿嘧啶，最后会被读取为T。然后加入UvrD解旋酶，得到A3A作用的单链DNA底物。脱氨作用后双链DNA不再完全互补，可以显著降低双链稳定性，因此可以很容易地通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。最后在DNA链两端加上测序引物，其中read 1 (P7引物)是原始链，read 2 (P5引物)是复制链。读数据是成对对齐的，因此read 1与它的互补链read 2匹配。通过计算解析两个reads的同源残基以产生单个遗传或表观遗传字母。最终得到5种模式的遗传信息表，剩余的11种非允许配对(标记为N)在解析的读取和读取本身时被保留下来，这样可以使得最终产生最小的信息损失和高精度的读取级别。
 

Five-letter seq
 

　　为了验证Five-letter seq的准确性，研究人员将这种方法和WGBS和EM-seq比较，发现Five-letter seq不仅展现了很好的碱基准确性，同时也对DNA表观修饰具有高精度的检测效率。
 

　　之后，研究人员还提供了一种Six-letter seq的方法，在Five-letter seq的基础上，加入甲基复制(methyl-copy)步骤，利用DNMT5将5mC从原始链复制到互补链。最终5hmC受到糖基化保护，不能被复制。最终Six-letter seq可以得到具有6种种模式的遗传信息表，且通过测序验证可以很好地区分出C、5mC和5hmC(如下图)。
 

Six-letter seq
 

　　综上所述，研究人员提出了一个单碱基分辨率测序方法，能够再一个样品中同时完成DNA碱基测序和两个最常见的胞嘧啶修饰测序。该方法准确性高，需要起始DNA投入量低，且具有简单的操作流程和分析步骤。序列信息和表观信息的同时读取使得存储在基因组中的遗传信息了解更完整，在整个生物医学领域都将会有新的应用价值。
 

　　参考文献
 

　　1. Frommer, M. et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS 89, 1827–1831 (1992).
 

　　2. Vaisvila, R. et al. Enzymatic methyl sequencing detects DNA methylation at single-base resolution from picograms of DNA. Genome Res. 31, 1280-1289 (2021).
 

　　3. Liu, Y. et al. Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution. Nat. Biotechnol. 37, 424–429 (2019).
 

　　4. Füllgrabe, J. et al. Simultaneous sequencing of genetic and epigenetic bases in DNA. Nat Biotechnol (2023).