2022年12月22日，来自加州大学圣地亚哥分校的Gene W. Yeo和Karen B. Chapman研究组合作在Nature Methods上以Brief Communication形式发表了题为Multiplexed transcriptome discovery of RNA-binding protein binding sites by antibody-barcode eCLIP的文章，提出了一种新的抗体条形码eCLIP（antibody-barcode eCLIP, ABC）方法，极大提高了CLIP技术的便捷性和效率。

当前CLIP技术无法大规模应用主要存在两个限制因素。第一，所有基于CLIP的方法都要先通过SDS-PAGE分离蛋白然后转移到硝化纤维膜上，依据分子量大小选择免疫沉淀的蛋白-RNA复合物。这种人工切取蛋白质-RNA复合物条带的方法很繁琐，需要额外的1.5-2天，并且容易受到操作者之间差异的影响。第二，每个单独的RBP需要特定的免疫沉淀（IP）步骤，这对研究多个RBP所需的原始材料数量造成了负担。针对以上两个问题，研究团队人员通过加入DNA条形码抗体，优化了eCLIP的两个限制，允许基于珠上近距离的连接（on-bead proximity-based ligations）取代SDS-PAGE和膜转移步骤。此外，DNA条形码还可以区分同一样品中不同RBP，极大地降低了每个RBP的起始样品量。研究人员将这种方法命名为抗体条形码eCLIP（antibody-barcode eCLIP, ABC），具体流程如下图。

具体地，研究人员使用两种特征明确的RBP评估抗体条形码eCLIP新方法，分别是RNA结合Fox-1同源物2 （RBFOX2），它识别GCAUG基序，以及茎环结合蛋白（SLBP），它与组蛋白mRNA特异性相互作用。研究结果表明抗体条形码eCLIP和常规eCLIP得到的结果基本一致，如下图。这也验证了体条形码eCLIP方法的可行性和准确性。

抗体条形码eCLIP的一个决定性优势是可以从单个样本中同时检测多个RBP，因此研究人员在K562细胞中选择了9个先前在ENCODE3中报道过的RBP，来展示基因区域内已知结合位点的多样性，其中包含5' UTR中的DDX3和EIF3G；3' UTR中的IGF2BP2、FAM120A、PUM2和ZC3H11A；CDS中的LIN28B；3'剪接位点的SF3B4和5'剪接位点下游的PRPF8。经过比对分析表明抗体条形码eCLIP和单独eCLIP方法的检测结果相似，见下图。

综上所述，研究人员提出了一种称为抗体条形码eCLIP的新方法，在使用单一eCLIP实验相同材料的基础上，不仅简化了操作流程，同时也极大增加一次性检测RBP的通量，这将有助于样品来源稀少，且往往投入有限的临床标本检测。

参考文献

1. Ule, J., Jensen, K., Mele, A. & Darnell, R. B. CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods 37, 376–386 (2005).

2. Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L. & Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome-wide protein-RNA interactions. Wiley Interdiscip. Rev. RNA 9, e1436 (2018).

3. Hafner, M. et al. CLIP and complementary methods. Nat. Rev. Methods Primers 1, 20 (2021).

4. Daniel L. et al. Multiplexed transcriptome discovery of RNA-binding protein binding sites by antibody-barcode eCLIP. Nature Methods 20, 65–69 (2023).