赛默飞荧光定量PCR仪的工作原理
时间：2024-11-29 阅读：123
赛默飞荧光定量PCR仪的工作原理
赛默飞荧光定量PCR仪（Thermo Fisher Scientific Real-Time PCR Systems）是基于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术的荧光定量检测设备，其核心原理是通过实时监测荧光信号的变化来定量分析核酸扩增过程，揭示目标DNA或RNA的起始量。以下是赛默飞荧光定量PCR仪的详细工作原理：
1. 基本工作流程
赛默飞荧光定量PCR仪的工作流程可以分为以下几个阶段：
(1) 样本准备
提取核酸：目标DNA或RNA从细胞、组织或其他样本中提取。
反转录（对于RNA样本）：使用逆转录酶将RNA转录为cDNA。
(2) PCR反应设置
反应体系：PCR混合液包括模板核酸、引物、探针或荧光染料、dNTP、Taq DNA聚合酶及缓冲液。
PCR试剂：
使用特定荧光标记的探针（如TaqMan探针）或荧光染料（如SYBR Green）以实时监测扩增反应。
(3) PCR循环
PCR反应在热循环系统中分为以下三个步骤，循环30-40次：
变性：高温（通常为95℃）使双链DNA分离为单链。
退火：降低温度（通常为55-65℃），引物与模板DNA结合。
延伸：通过Taq DNA聚合酶在72℃合成新链。
(4) 荧光信号检测
赛默飞荧光定量PCR仪内置的光学检测系统实时监测每个PCR循环中的荧光信号变化。
荧光强度与目标核酸的扩增量成正比。
2. 荧光定量PCR的关键技术
(1) 荧光信号产生与检测
赛默飞荧光定量PCR仪使用荧光探针或染料标记扩增反应的产物，具体技术包括：
TaqMan探针法
探针是一段带有荧光标记和猝灭基团的寡核苷酸。
工作原理：
在PCR延伸阶段，Taq DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将探针降解，释放荧光基团，使荧光信号得以监测。
荧光强度与扩增产物数量呈线性相关。
SYBR Green染料法
SYBR Green是一种嵌入双链DNA的荧光染料。
工作原理：
随着PCR反应中双链DNA的生成，SYBR Green嵌入其中，产生荧光信号。
荧光强度的增加反映扩增产物的累积量。
高分辨率熔解曲线分析（HRM）
HRM技术通过监测DNA解链时的荧光信号变化，用于检测单核苷酸多态性（SNP）和突变分析。
(2) 定量方法
赛默飞荧光定量PCR仪通过以下两种方式实现核酸的绝对定量或相对定量分析：
绝对定量
使用标准曲线，通过已知浓度标准品的荧光信号，计算未知样本中核酸的起始量。
相对定量
通过参考基因的表达量对目标基因进行标准化分析，适合基因表达研究。
(3) 光学检测系统
赛默飞荧光定量PCR仪配备多色光学检测系统：
使用LED光源激发荧光。
CCD相机或光电二极管阵列捕获荧光信号。
系统实时采集荧光信号并进行数据分析。
3. 数据分析与结果输出
赛默飞荧光定量PCR仪通过内置的软件平台对荧光信号进行分析，主要步骤包括：
(1) 阈值循环数（Ct值）
Ct值是荧光信号达到设定阈值时的PCR循环数。
Ct值越低，模板起始量越高。
(2) 标准曲线分析
通过绘制标准曲线，计算未知样本的绝对浓度。
(3) 熔解曲线
熔解曲线用于验证PCR扩增的特异性，单一峰值表明反应特异性好，多峰值可能提示非特异扩增或引物二聚体。
(4) 定量结果展示
数据可通过曲线图、柱状图等形式直观展示，便于分析。
4. 赛默飞荧光定量PCR仪的优化设计
高灵敏光学检测
多通道荧光检测系统可同时监测多个靶标，确保实验灵活性和高效性。
快速热循环系统
赛默飞仪器通过精准的温度控制系统，加速PCR反应，缩短实验时间。
智能化软件平台
支持自动分析Ct值、熔解曲线，简化数据处理流程。
云端连接功能，支持远程实验管理和数据共享。
兼容性与灵活性
支持96孔、384孔板和TaqMan Array卡等多种平台。
灵活适配不同荧光染料和探针。
5. 赛默飞荧光定量PCR仪的优势
灵敏度高：精确检测低丰度模板。
多通道检测：最多支持8色荧光检测，适合多重实验。
实验效率高：快速模式大幅缩短反应时间。
特异性强：采用TaqMan探针，避免非特异性扩增影响结果。
便捷操作：直观界面设计，支持自动化运行。
6. 应用领域
基因表达分析
精确定量基因表达变化，用于研究基因调控机制。
病原体检测
快速、准确检测病毒和细菌，核酸检测。
遗传突变分析
检测SNP和点突变，适合癌症研究和遗传性疾病筛查。
药物筛选
高通量基因表达分析，为新药开发提供支持。
分子诊断
应用于个性化医疗，通过实时检测提供临床诊断依据。
总结
赛默飞荧光定量PCR仪通过先进的光学检测系统、灵敏的荧光探针技术和高效的反应体系，确保实验数据的精确性与可靠性。其工作原理结合TaqMan探针法和SYBR Green染料法，支持多种定量检测需求。同时，智能化操作和多样化适配平台使其广泛应用于科研和临床领域，为分子生物学研究提供强有力的技术支持。