高效Gyolab抗药抗体检测解决方案，简化操作同时提高精确度
时间：2024-12-10 阅读：90
Gyrolab平台采用自动化进样方式在微流控CD上进行小型化免疫检测。CD微结构中填装链霉亲和素包被的亲和微珠，通过生物素化捕获试剂与分析物特异性相结合，再与荧光标记的检测试剂结合，通过激光激发亲和柱上的荧光信号并用检测器对荧光信号进行读数。Gyrolab免疫测定法具有自动化、通量高、节省时间、试剂与样品用量少、动态范围广和基质效应低等优势，已在生物药物研发和生产领域得到广泛应用。
Gyrolab采用均相桥联格式 (homogenous bridgingformat) 检测ADA， 药物分子同时用作捕获试剂 (生物素化) 和检测试剂 (Alexa Fluor® 647荧光标记) ，样品和试剂混合后再加入CD 微结构的链霉亲和素柱中，然后检测 ADA 或阳性对照在生物素化的药物分子和荧光团标记的药物分子之间形成桥接复合物 。这种检测形式可检测所有同种型的 ADA (IgG、IgM、IgA 等) 且不依赖于物种，既可用于临床前也可用于临床研究。
Gyrolab平台提供ADA检测的完整解决方法，简化从筛选试验到确证试验开发的工作流程，包括ADA分析软件模块、Rexxip ADA样品稀释缓冲液和两种不同格式的CD。
Gyrolab Mixing CD 96是专用于酸解法检测ADA的微流控CD，它将样品酸解离预处理步骤整合到自动化检测流程中。每片Mixing CD上有96个微结构，每个微结构中均有一个样品混合室可用于样品孵育和酸解离。进行ADA检测时，首先将样品加入微结构中的体积定义通道，200 nL样品在CD离心力作用下进入混合室，接着加入酸性缓冲液到混合室中，ADA-药物复合物可在低 pH 环境中解离。然后将含有捕获试剂和检测试剂的 Master Mix中和缓冲液中加入混合室，ADA分子与标记试剂接触并形成新的 ADA 复合物。这样使标记试剂与未标记游离药物的比例有利于形成可检测的标记试剂-ADA桥接复合物，最后将复合物捕获到链霉亲和素包被的微珠上，并通过激光诱导荧光检测器进行检测。这一检测流程实现了从样品试剂添加、在线酸解离再到信号检测的全自动化，自动化程序精确控制每个步骤的时间和反应体积，最大限度地减少了动手操作，不仅显著提高了检测精确度，而且大幅缩短了分析时间。
Gyrolab支持两种不同的样品预处理方式来克服游离药物对ADA检测的干扰，可根据药物特性和应用情况灵活选择适用的方法。使用Gyrolab技术进行ADA检测的主要优势包括：
纳升级的反应体系，试剂和样品用量少
自动在线酸解离，提高检测精密度
亲和柱流穿技术将基质效应最小化，提高检测灵敏度和药物耐受性
亲和柱高载量更有利于高浓度的标记试剂与游离药物竞争，通过计量优势进一步提高药物耐受性
分析速度快，每片CD的运行时间约1小时，采用Mixing CD 96在线酸解离检测运行时间约2小时
动手操作少，减少人为误差
专用ADA软件模块按照监管标准指导筛选试验和确证试验开发流程
免疫原性检测方法的关键参数包括检测灵敏度、药物耐受性和选择性。药物耐受性是指在残留治疗药物的情况下检测抗药物抗体 (ADA) 的能力, 评估游离药物与ADA的结合情况是为了避免出现假阴性的风险。选择性是指在正常基质或疾病基质的情况下评估检测的稳健性，对于确保临床研究中评估不同样本时的一致性至关重要。另外，在使用桥联法进行ADA检测时的一大挑战是靶点的干扰，临床样本中存在的二聚体或多聚体形式的可溶性靶点可能会导致假阳性结果。
Novimmune SA公司研究人员在开发针对一种治疗性抗体药物 (Novimab) 的ADA检测方法的过程中，采用Gyrolab和ECL (Electochemiluminescence, ECL) 技术对不同方式处理的样品进行了检测 (靶点耗竭样品、非靶点耗竭样品、酸化样品和非酸化样品) ，并对两种检测方法的关键参数例如灵敏度、药物耐受性和靶点耐受性进行了评估和比较，以获得符合目的 (Fit-for-purpose) 的临床免疫原性检测方法[1]。
研究人员使用生物素化的药物作为捕获试剂，Alexa Fluor® 647标记 (Gyrolab) 或Sulfo-tag标记 (ECL) 的药物作为捕获试剂，纯化的多克隆兔抗药物抗体作为ADA阳性参照物，在两个平台上以均相桥联格式进行ADA检测。Gyrolab平台使用Bioaffy 200 CD进行非酸化样品检测，Mixing CD 96进行酸化样品检测，样品酸解离和中和在Mixing CD上自动完成。
在三天里对一个阴性对照样品(NC) 和九个阳性对照样品 (PC , 2、5、20、50、100、250、500、1000 和 10000 ng/mL ADA) 进行检测，根据 3 次检测间运行的结果确定灵敏度，即持续返回高于阈值信号的z低 PC 浓度。
两种方法的灵敏度都很高，低于100 ng/mL。对于非酸化样品检测，Gyrolab和ECL平台的灵敏度均为2 ng/mL；对于采用酸解离步骤的样品，Gyrolab检测的灵敏度为5 ng/mL, 高于ECL的20 ng/mL的灵敏度。
在非酸解和酸解离条件下，Gyrolab和ECL平台对PC样品检测的信号值。X轴为ADA参照物浓度，Y轴为信噪比 (PC 信号均值除以 NC 信号均值)
在两个平台上使用经优化后的最佳条件，分别对酸化和非酸化样品的检测进行了比较研究：在含有 0、20 和 100 µg/mL单抗药物的情况下，对九种 PC 样品 (5、20、50、100、250、500、1000、2500 和 10000 ng/mL ADA) 进行了检测，数据显示Gyrolab 平台显示出更高的药物耐受性。对于未经酸化的样品检测，在 20 µg/mL和 100 µg/mL的药物浓度下，Gyrolab可分别检测到 100 ng/mL 和 500 ng/mL 的 ADA，ECL平台可分别检测到 250 ng/mL 和 1000 ng/mL 。对于酸解离样品检测，在药物浓度为20 µg/mL时，Gyrolab可检测到5 ng/mL ADA, ECL平台为50 ng/mL；当药物浓度水平提高到100 µg/mL时，两种平台的检测灵敏度均为50 ng/mL ADA。
在药物水平为0, 20和100 µg/mL的条件下，两种平台的检测灵敏度。灵敏度定义为超过阈值信号的z低PC浓度。
在本研究中，可溶性靶点可能形成二聚体干扰检测造成假阳性结果，而且在疾病人群中，可溶性二聚体靶点的基础水平可能远远高于健康人血清中测得的水平，所以提高检测方法的靶点耐受性对于临床分析非常重要。
为了评估靶点耗竭步骤的效率，将含有四种不同浓度可溶性二聚体靶点 (5、20、50 和 200 ng/mL) 的样品分成两组，一组进行靶点耗竭前处理，另一组则不做靶点耗竭，然后分别在两个平台上进行有/无酸解离步骤的检测。数据显示，在没有酸解离的情况下，Gyrolab和ECL检测都只能耐受5 ng/mL 的可溶性二聚体靶点；通过将靶点耗竭和酸解离步骤结合，两个平台的靶点耐受水平都提高到了200 ng/mL。
在无酸解离或无靶点耗竭步骤条件下，评估两个平台在不同可溶性二聚体靶点浓度下的耐受性。虚线所代表的阈值固定为信噪比1.25。
两个平台在不同可溶性二聚体靶点浓度下的检测结果，符号 "+"和"-"分别表示样本信号高于或低于阈值。
使用仅含有游离ADA的样本进行了检测间精密度评估，包括酸解离样品和未经酸解离样品的检测。在不同日期使用ECL平台对九种不同浓度的 PC (2、5、20、50、100、250、500、1000 和 10000 ng/mL) 进行3次独立检测，使用Gyrolab平台对五种不同浓度的PC (5、20、100、500 和 10000 ng/mL) 进行5次独立检测，根据每种 PC 水平获得的信号值计算运行间精密度 (CV%)。数据显示，在没有酸解离步骤的情况下，Gyrolab和ECL检测的精密度都很高，所有 PC 样品的CV均低于 10%；但在酸解离检测中，明显观察到ECL检测的CV从10%增加到 26%，而Gyrolab检测依然保持了良好的精密度，除5 ng/mL PC样品外，其他样品检测的CV均低于10%。这是因为Gyrolab技术采用全自动化酸解离处理，减少了人工操作和误差，从而降低了结果的变异性。
检测间精密度，“NT” 表示未进行检测，“<blq”< span="">表示低于方法检测灵敏度。
本研究数据显示，Gyrolab和 ECL技术在ADA检测的灵敏度、药物耐受性、靶点耐受性和精密度等参数方面均表现出良好的性能，两种检测方法都适用于方法验证和临床样本分析
对采用酸解离步骤的样品检测，Gyrolab具有更高的检测灵敏度和药物耐受性
Gyrolab平台集成全自动样品酸解离，减少了动手操作和误差，提高了检测间的结果重复性
Gyrolab检测所需的试剂量更少，检测运行时间更短，通量更高
参考文献：
[1] Collet-Brose J, Couble PJ, Deehan MR, Nelson RJ, Ferlin WG, Lory S. Evaluation of Multiple Immunoassay Technology Platforms to Select the Anti-Drug Antibody Assay Exhibiting the Most Appropriate Drug and Target Tolerance. J Immunol Res. 2016;2016:5069678. doi: 10.1155/2016/5069678. Epub 2016 May 3. PMID: 27243038; PMCID: PMC4868908.