PCR程序设置和什么有关？影响大么？

一旦确定了合适的DNA起始量和PCR组分，就必须设定PCR循环和运行参数，从而确保高效扩增。

DNA聚合酶的特点、PCR缓冲液的类型、模板DNA的复杂程度都会影响反应条件的设置。

1、起始高温变性步骤

在PCR起始阶段，通常是在94–98℃下孵育1-3min将双链DNA模板解离成单链，从而使引物可与目标区域结合并开始延伸。

此步的高温条件使起始DNA变性，确保在第一个扩增循环期间实现有效的目标序列扩增，此外也有助于使样品中可能存在的热不稳定性蛋白酶或核酸酶失活，从而保证它们极小影响热稳定性DNA聚合酶。

同时，当使用热启动DNA聚合酶时，此步同时可以激活该聚合酶。

起始变性步骤，该步骤的时间和温度取决于模板DNA的性质和缓冲液的盐浓度。

例如，哺乳动物基因组DNA可能比质粒和PCR产物需要更长的孵育时间（具体取决于DNA的复杂程度和大小）。

同样，高GC含量（如， >65%）的DNA通常需要更长的孵育时间或更高的温度。高盐浓度的缓冲液（满足某些DNA聚合酶的需要）同样需要更高的变性温度（如，98℃），以使双链DNA解离。

在95℃以上长时间孵育，很容易使Taq DNA聚合酶等DNA聚合酶变性。为弥补在该步骤中酶损失的活性，可能需要在起始变性步骤后添加更多的酶，或在一开始加入多于建议用量的DNA聚合酶。高度热稳定的酶(如来自Archaea的酶)能够耐受长时间高温孵育，在整个PCR过程中保持活性。

2、循环变性步骤

起始变性步骤后，后续PCR循环以一个独立的变性步骤开始，并在94–98℃条件下持续0.5-2min。

与起始模板DNA变性步骤一样，该步骤的时间和温度也可根据模板DNA、DNA聚合酶和缓冲液成分的性质进行优化。

例如，更长时间和/或高温条件对长片段和/或富含GC的目的片段可能是有利的。

甘油、DMSO、甲酰胺和甜菜碱等添加剂的存在，可促进变性步骤期间双链DNA的解离并提高特异性，从而无需长时间或高温条件。

3、引物退火步骤

在该步骤中，目的是降低反应温度，使引物与目标DNA结合。

通常，0.5-2min的孵育时间足以供引物完成退火。通过计算PCR扩增引物的熔解温度（Tm），可确定退火温度。根据一般经验法则，起始退火温度比引物低至Tm低3–5℃。

Tm指50%的引物与其互补序列形成双链时的温度，可通过多种方法进行计算。引物Tm估算简单的方法是利用DNA寡核苷酸中的核苷酸数量进行计算，公式如下：Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T)。

由于反应的盐浓度 (Na⁺) 会影响引物退火，因此，使用以下公式能够更加准确地计算Tm：Tm=81.5+16.6(log[Na⁺]) + 0.41(%GC)–675/引物长度。

Tm计算需考虑的一个重要因素是PCR添加剂、辅助溶剂和修饰核苷酸的使用。这些试剂的存在会降低引物-模板复合物的Tm。

例如，10%DMSO会使退火温度降低5.5–6.0℃。同样，在PCR中使用7-deaza-dGTP取代dGTP也会降低Tm。此时，应相应调整退火温度。

7-Deaza-dGTP是一种人工合成的dGTP类似物，可作为大多数DNA聚合酶(包括Taq DNA Polymerase)的底物。

与dGTP相比，7-Deaza-dGTP具有更高的电子亲和力化学稳定性，这使得它在DNA合成反应中更容易被酶识别和嵌入，从而提高了DNA合成的效率和准确性。7-Deaza-dGTP掺入DNA后可影响DNA的荧光染色和电泳迁移率；与dITP相比，7-Deaza-dGTP提升了长序列区域的易读性。

7-Deaza-dGTP替代或部分替代dGTP扩增富含GC的DNA序列，可提升有效降低PCR反应错误率，提高PCR产物产量，使DNA测序更加简单高效，广泛应用于富含GC的DNA序列的PCR扩增、测序和基因克隆等生物实验，在疾病诊断中发挥重要作用。

应注意，计算所得 Tm 值就是引物退火的起始参考温度。退火温度可能需要根据扩增结果进行进一步优化。

例如，如果结果为无扩增条带或扩增水平很低，则优化时应以2–3℃增量逐渐降低退火温度。但是，如果出现非特异性PCR产物，则以2–3℃增量逐渐提高温度（最高至延伸温度），提高特异性。

4、引物延伸步骤

引物退火后，便是延伸引物的3'末端，产生模板的互补链。该步中，DNA聚合酶的5'→ 3'聚合酶活性引入dNTP并合成子链。

反应温度升高至酶的最佳温度（热稳定DNA聚合酶的最佳温度通常为70–75℃），使其达到最高活性。

如果引物退火温度与延伸温度相差不超过3℃，则退火和延伸温度可合并为一步，称为两步PCR法。两步PCR法无需在退火和延伸之间转换和稳定温度，从而缩短了PCR所需的时间。

PCR的延伸时间取决于DNA聚合酶的合成速度以及目标DNA的长度。

Taq DNA聚合酶的一般延伸时间是1min/kb，而 Pfu DNA聚合酶为2min/kb。因此，“缓慢型”聚合酶比“快速型”聚合酶需要更多的扩增时间，才能获得相等的得率。

同样，长DNA扩增子比短DNA需要更长的延伸时间，才能实现全长复制。当扩增长目的片段（如， >10 kb）时，除了需要增加延伸时间，还需要降低PCR温度，以确保引物结合并在长时间循环中维持酶活性。

5、PCR循环数设置

为扩增目标DNA，需重复PCR的变性、退火和延伸步骤多次。循环数通常为25-35次，具体取决于DNA起始量和所需的目标PCR产物得率。

如果DNA起始量少于10拷贝数，则可能需要多达40个循环，才可获得足够的得率。不建议使用超过45个循环，因为过多的循环数会产生非特异性条带。而且，副产物的累积和反应组分的消耗会大大降低PCR效率，使PCR扩增曲线出现平台期。

相反，较少的循环数更适合于无偏倚扩增（如下一代测序）以及目标DNA的准确复制（如克隆）。

6、最终延伸步骤

最后一个PCR循环完成后，即为最终延伸步骤。该步中，将PCR混合物在延伸温度（通常为72℃）下最后孵育5-15min。其持续时间取决于扩增子长度和组成，以确保全长复制以及高目标DNA片段得率。

在该步骤中，除了填补不完整末端外，Taq DNA 聚合酶等具有末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）活性的DNA聚合酶还会在PCR引物的3'末端添加额外的核苷酸。

因此，如果PCR扩增子被克隆到TA载体中，建议最终的延伸步骤持续30min，以确保生成合适的3'-dA尾部结构以实现有效的PCR克隆。

参考文献：

［1］PCR循环参数—成功的六大关键因素-赛默飞

［2］7-Deaza-dGTP (10mM, for GC-Rich PCR/Sequencing)-碧云天

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