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什么是荧光定量PCR?

时间：2024-12-04 阅读：93

实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量的一种PCR技术。

一、荧光化学物质

Real-time qPCR所使用荧光化学物质有荧光染料和荧光探针两类。

1、荧光染料

目前主要使用的荧光染料是SYBR Green I，SYBR Green I是一种嵌入型花箐染料，在488nm（蓝光）照射激发后，在522nm（绿光）具有发射高峰。

SYBR Green I是嵌在DNA螺旋的小沟里面的，一般用来染双链DNA，在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

YBR Green I 与双链DNA的亲和力非常高，对分子生物学中常用的酶（如：Taq 酶、逆转录酶、内切酶、T4连接酶等）没有抑制作用。

SYBR染料-DNA复合物在非极性溶液中可解离，可用乙醇沉淀的方法将SYBR Green I 从DNA中去除。SYBR Green I能够被玻璃表面强烈吸收，染料溶液应该在塑料容器中配制。

SYBR Green I 染料法即将SYBR Green I染料添加到PCR反应体系中时，SYBR Green I能够结合到模板和扩增产物发出荧光；随着每轮扩增，产物量呈指数型上升，荧光信号也随之累积并被仪器检测到。

2、荧光探针

Real-time qPCR中常用的荧光探针为TaqMan探针，其基本原理是依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的FRET探针，该探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收而不能发出荧光；PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间；当扩增延伸到探针结合的位置时，PCR酶利用5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，从而使其发出荧光。

荧光信号被荧光监测系统接收，检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。

1）荧光共振能量转移FRET

荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基团（受体 Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离临近至一定范围时（一般小于100Å／10nm），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种荧光基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。

简单地说，就是在供体基团吸收一定频率的光子后第一电子发生能级跃迁被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移的过程。

此过程没有光子的参与，所以是非辐射的，供体分子被激发后，当受体分子与供体分子相距一定距离，且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时（同一振荡频率），处于激发态的供体将把一部分或全部能量转移给受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光熄灭；如果受体也是一种荧光发射体，则呈现出受体的荧光，并造成次级荧光光谱的红移。

①FRET发生条件：

a.供体分子的发射光谱应与受体分子的激发光谱必须有显著重叠（＞30%）。

b.供体分子与受体分子的作用距离必须在1-10nm之间，基团间的FRET效率可由E=1/［1+(R/R0)⁶］反映（R表示基团分子之间的距离；R0表示E=50%时供体和受体分子间的距离，依赖荧光基团发射谱和淬灭基团激发谱的重叠程度以及基团能量转移的偶极子的相对方位，对于特定的供体受体对是常数）。

FRET程度与基团之间的空间距离紧密相关，随着距离延长，FRET呈显著减弱。

c.供体分子的发射态偶极矩与受体分子的吸收态偶极矩、以及它们的向量必须满足一定的条件。

②FRET的应用

a.检测分子间相互作用：

b.检测分子的折叠与构像变化：

2）TaqMan探针

①设计原则：

a.长度：建议15-30bp，以保证结合特异性；扩增子长度应小于150 bp。

b.Tm值：68-72℃，高于引物8-10℃，可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合，也确保探针与模板结合的稳定性大于引物与模板结合的稳定性，最好富含GC。

c.5'端／3'端：探针5'端避免为G，G碱基一定程度上对5'端荧光有淬灭作用，避免报告基团的荧光在探针切割后发生淬灭；3'端需进行封闭，以防止在PCR中起引物的作用进行延伸，TAMRA等基团本身可进行封闭。

d.碱基分布：GC含量在30%~80%之间，一条探针中，C含量多于G，G含量高会降低反应效率，这时可选择互补的另一条链作为探针，避免单个核苷酸成串，如GGGGG。

e.结合位置：探针退火时，应尽可能接近上游引物，同时又不重叠，离上游引物的3'端至少相差一个碱基；如果Taqman探针是用于检测等位基因或突变位点,则应将错配核苷酸放在探针中间，不能放在末端。

e.纯化方式：建议选择HPLC纯化。

②保存：TaqMan探针必须避光保存，避免荧光基团降解。

3）TaqMan探针法优点

①特异性强：

探针法qPCR要达到检测的目的，不仅要上下游引物要跟模板匹配，还需要探针与模板匹配，提升了检测的特异性。另外一方面，对于模板同源性比较高的不同目的基因的检测和鉴定，在扩增引物特异性没法保证的情况下，可通过设计探针的特异性来达到特异性检测的目的。而且特异性的探针比特异性的引物对模板序列的特异性要求要低，只要模板有几个碱基甚至1个碱基的差异就能设计特异性的探针，而这对于扩增引物是无法实现的。

②准确性、灵敏度高：

从探针法qPCR原理来看，扩增引物和探针序列都匹配后扩增的产物才能产生荧光信号，这样就确保了荧光信号是目的片段的扩增产生的，排除了非特异性扩增的影响，从而保证了检测的准确性。特别是针对一些低拷贝和低浓度的样品，染料法qPCR随着循环数的增加容易出现引物二聚体的信号干扰，导致检测结果不准，而这种情况在探针法qPCR上不存在，因为即使出现引物二聚体，由于其不是目的片段，没有探针结合位点，所以也不会产生荧光信号。这也体现了探针法qPCR检测低拷贝样品的高准确性和高灵敏度。

③可进行多重检测：

在探针的5'端标记不同的荧光修饰，则不同的探针在检测过程中就会发出不同的荧光信号。根据此原理，可以将检测不同目的基因或者基因型的探针标记不同的荧光修饰，用做混合检测，这样就可以做多重检测，检测对应的荧光信号就是检测对应探针的荧光定量结果，多重检测大大节省检测成本和检测时间，进一步提高了检测的速度和适用性。

二、定量原理

理想的PCR反应：X＝X₀*2ⁿ；实际的PCR反应：X＝X₀*(1＋Ex)ⁿ（n：扩增反应的循环次数，X：第n次循环后的产物量，X₀：初始模板量，Ex：扩增效率）；在扩增产物达到阈值线时：XCt＝X₀*(1＋Ex)ᶜᵗ＝S （XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后，它是一个常数，设为S）；方程式两边同时取对数得: lgS＝lg［X₀*(1＋Ex)ᶜᵗ］，整理方程式得: lgX₀＝-lg(1＋Ex) ᶜᵗ＋lgS。

结论：

①模板DNA量越多，达到荧光阈值的循环数越少，即Ct值越小。

②lg浓度与循环数呈线性关系。

a. 根据样品扩增达到阈值的循环数（Ct值）即可计算出样品中所含的模板量。(相对定量)

b. 通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，即可计算出样品中所含的模板量。（绝对定量）

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