免疫沉淀中的高背景无法避免？

一定要对样品溶液进行预清除？

更高的结合能力对免疫沉淀更好？

高质量的磁珠价格昂贵？

免疫沉淀实验想必大家并不陌生，采用琼脂糖珠作为介质更是免疫沉淀的常用方法。琼脂糖珠介质历来有一些难以克服的挑战，导致人们对免疫沉淀持有一些并非总是正确的普遍看法。如何能让免疫沉淀实验事半功倍，自然需要对 “四大误解”有深入了解。

误解1：背景是不可避免的

要理解这个“误解”，首先需要知道什么是背景以及它的来源。免疫沉淀实验中的背景是一种额外的非特异性信号，与抗原或相关蛋白质的质量大小不一致。背景主要由两个原因引起：1) 未将上清液与颗粒/树脂或珠子清晰分离；2) 琼脂糖或 Sepharose 树脂的孔隙。当使用Sepharose或琼脂糖树脂的混悬液法时，是没有明确沉淀物的。因此，研究人员可能会意外地去除过多的混悬液（和宝贵的样品），或者去除不足，导致样品中含有可能提升背景的不需要的蛋白质。多孔的Sepharose/琼脂糖树脂会吸附液体，以及不需要的蛋白质。即使进行了多次洗涤，仍然很难去除干扰性蛋白质，导致背景较高。

小贴士：如何减少免疫沉淀中的背景

Dynabeads磁珠可以被磁化，与磁力架一起使用时，可轻松将其拉到样品管的一侧。这一特点使得移除缓冲液或上清液变得非常容易，不会造成任何破坏或样品损失。

Dynabeads磁珠的一个关键特点是其表面清晰，没有孔隙。所有的结合都发生在外表面，从而防止任何不需要的蛋白质被困在内部。

为了进一步减少免疫沉淀中的背景，建议洗涤含有感兴趣蛋白质的磁珠，以去除任何不需要的蛋白质或蛋白质片段。

图1. 用于免疫沉淀的 Dynabeads Protein A 磁珠与其他供应商的对比。进行Western blot来比较使用1）Sepharose离心柱、2）Sepharose混悬液、3）琼脂糖混悬液和离心柱、4）树脂离心柱、5）Dynabeads Protein A磁珠的方案时间和背景的差异（每种方法一式两份）。Dynabeads Protein A磁珠的免疫沉淀具有低背景且至少节省14分钟的时间。

误解2：为获得高质量的免疫沉淀结果，必须对样品溶液进行预清除

这个误解认为，非目标蛋白的其他蛋白质可能会与固相发生非特异性结合。为了解决这个问题，通常会进行预清除步骤，即将固相（不含抗体）加入样品中一段时间，然后移除，以去除不需要的非特异性蛋白质和背景。然而，进行免疫沉淀的预清除步骤需要使用双倍量的固相，并增加了整个免疫沉淀方案所需的时间。

小贴士：无需预清除样品溶液，即可避免背景干扰

使用 Dynabeads 磁珠与特异性抗体偶联后，无需预清除，因为它并不识别非特异性蛋白质。这种方法不仅节省了一半的固相使用量，还减少了实验所需时间。

图2. 不进行预清除的Dynabeads  Protein G磁珠与进行预清除的Sepharose Protein G珠之间的背景水平比较。进行Western blot来比较两种方法的背景水平，1）进行预清除的Sepharose Protein G珠和2）不进行预清除的Dynabeads Protein G磁珠（每种方法的样品一式八份）。结果显示，使用Dynabead Protein G磁珠进行免疫沉淀能始终沉淀出更多的相关蛋白。

误解3：更高的结合能力对免疫沉淀更好

这个误解是基于琼脂糖和Sepharose珠子的抗原结合能力。琼脂糖和Sepharose珠子具有外表面和内表面，蛋白质可以结合的区域很大，从而导致高结合能力。这种高结合能力意味着这些珠子和树脂也可以与样品中的其他蛋白质非特异性结合。研究人员在选择IP技术时需要在结合能力、产量、特异性和成本之间取得平衡。

小贴士：平衡结合能力、产量和特异性

可以使用磁珠，磁珠外表面与能识别相关蛋白质的抗体结合。由于使用柱式免疫沉淀方法以外的免疫沉淀只需要1-10 µg的抗体，因此并不需要高结合能力的试剂，而且成本效益不高。只需使用实验所需的确切量即可，这样可以节省实验室的抗体、试剂和免疫沉淀磁珠。

误解4：高质量的磁珠价格昂贵

研究人员可能会认为Dynabeads磁珠价格昂贵，而琼脂糖/ Sepharose混悬液则更具成本效益。然而，如果考虑到磁珠不需要预清除步骤，那么每个样品的价格是相当的，甚至可能更低。

在计算免疫沉淀的成本时，研究人员可能会考虑固相的成本与固定体积固相的结合能力。然而，正如我们在误解3中了解到的，固相的高结合能力对于免疫沉淀实验并不关键，可能是多余的，导致使用更多昂贵的抗体。

小贴士：计算使用 Dynabeads 磁珠节省的成本

计算免疫沉淀成本的正确方法是查看进行一次免疫沉淀所需的磁珠和抗体的用量。由于琼脂糖/ Sepharose混悬液通常需要预清除，因此这些珠子的成本必须加倍。由于Dynabeads磁珠具有较少的非特异性结合且不需要预清除，因此在免疫沉淀实验中使用Dynabeads磁珠比使用琼脂糖/ Sepharose珠更具成本效益。

可以说，利用磁珠的免疫沉淀技术的发展帮助科学界克服了关于免疫沉淀的特定误解，从而为需要优化其免疫沉淀实验的科学家提供了支持。

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