牛奶中β-内酰胺酶检测法
时间：2010-03-24 阅读：2338
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天津市兰博实验仪器设备有限公司 -
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“无抗奶”，顾名思义，即不含抗生素的牛奶。早在2002年，这一概念便被提出，“无抗生素”的字样也登上了乳品包装。
为何牛奶含抗生素？
牛奶中的抗生素来自乳牛，乳牛被注射抗生素，主要是治疗乳腺发炎。乳腺炎是奶牛常见病，抗生素的使用是业内“公开的秘密”。牛奶中的抗生素可能导致饮用者过敏，或因长期接触抗生素而耐药。
如何做到“无抗”？
药品合理间隔期后才挤奶，可以生产无抗奶，可以通过检验抗生素的方式验证。
1、间接法
方法原理：利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶，那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会减少，从而判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶。
实验步骤：称取20 g试样，在4℃、16000rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管，并将塑料离心管置于37℃水浴锅中振荡孵育30 min。向孵育后的离心管中加入无水乙醇15 mL。振荡提取30 min后离心，将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。减压浓缩蒸发掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH=8.5），涡旋1 min后调节pH为8.5。以1 mL/min的速度将提取液通过经过预处理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸缓冲液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2 mL水淋洗。zui后用3 mL乙腈洗脱。将洗脱液在40℃下氮气吹干，用0.025 M磷酸盐缓冲液（pH=7.0）定容残渣至1 mL,待上机测定。
色谱条件：LabAlliance PC-2000液相色谱配2000型紫外检测器；
1、间接法
方法原理：利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶，那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会减少，从而判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶。
实验步骤：称取20 g试样，在4℃、16000rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管，并将塑料离心管置于37℃水浴锅中振荡孵育30 min。向孵育后的离心管中加入无水乙醇15 mL。振荡提取30 min后离心，将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。减压浓缩蒸发掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH=8.5），涡旋1 min后调节pH为8.5。以1 mL/min的速度将提取液通过经过预处理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸缓冲液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2 mL水淋洗。zui后用3 mL乙腈洗脱。将洗脱液在40℃下氮气吹干，用0.025 M磷酸盐缓冲液（pH=7.0）定容残渣至1 mL,待上机测定。
色谱条件：LabAlliance PC-2000液相色谱配2000型紫外检测器；
lanbo色谱柱 :C18（4.6mm×150mm×5μm）；
流动相: 甲醇/0.004M 磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60；
检测波长: 268 nm
2、直接法
方法原理：牛乳中的青霉素钾在β-内酰胺酶的作用下，主要生成青霉噻唑酸钾，并伴随生成少量的青霉胺、青霉醛等物质。经去脂肪、蛋白等前处理后，可以将青霉噻唑酸钾提取出来，经液相色谱仪检测确认其是否存在，从而判定该牛乳是否为人造“无抗奶”。
实验步骤：称取20 g试样，在4 ℃、16000 rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管，加入无水乙醇15 mL，振荡提取30 min后离心，取清液经0.45 μm的滤膜过滤，用液相色谱仪检测。
标准溶液配制：称取0.01 g（至0.001 g）青霉素钾于100 ml容量瓶中，加入1ml市售抗生素分解剂，室温放置2h使青霉素钾酶解*后用去离子水定容，得到青霉噻唑酸钾标准溶液，浓度100 μg/mL。根据实际情况稀释后使用。
色谱条件：LabAlliance PC-2000液相色谱配2000型紫外检测器；
流动相: 甲醇/0.004M 磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60；
检测波长: 268 nm
2、直接法
方法原理：牛乳中的青霉素钾在β-内酰胺酶的作用下，主要生成青霉噻唑酸钾，并伴随生成少量的青霉胺、青霉醛等物质。经去脂肪、蛋白等前处理后，可以将青霉噻唑酸钾提取出来，经液相色谱仪检测确认其是否存在，从而判定该牛乳是否为人造“无抗奶”。
实验步骤：称取20 g试样，在4 ℃、16000 rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管，加入无水乙醇15 mL，振荡提取30 min后离心，取清液经0.45 μm的滤膜过滤，用液相色谱仪检测。
标准溶液配制：称取0.01 g（至0.001 g）青霉素钾于100 ml容量瓶中，加入1ml市售抗生素分解剂，室温放置2h使青霉素钾酶解*后用去离子水定容，得到青霉噻唑酸钾标准溶液，浓度100 μg/mL。根据实际情况稀释后使用。
色谱条件：LabAlliance PC-2000液相色谱配2000型紫外检测器；
lanbo色谱柱 :C18（4.6mm×150mm×5μm）；
流动相: 甲醇/0.004 M磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60；
检测波长: 230 nm