神经生长因子（NGF）是1951年是由诺贝尔生理学和医学奖获得者R. LeviMontalcini和S. Cohen在小鼠肉瘤细胞内发现的。NGF是一种蛋白质，含三种亚基α、β、γ，以α2βγ2五个亚基组成，分子量为1300000，通常称为7S NGF。只有β亚基具有促进神经生长的作用，用不同方法提取可以得到一种2.5S的NGF，大致相当于β亚基部。由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体，分子量为26600左右，等电点是9.3，不同种间NGF的结构具有高度的同源性，生物效应也无明显的种间特异性。图2-21为经典的NGF空间分子结构，红色：α亚基（功能尚不清楚），绿色：γ亚基（具有蛋白酶活性），蓝色：β亚基（具有生物活性的NGF）。目前有较多的文献采用反相高效液相色谱的方法进行快速简便的NGF含量的测定，但是作为生物活性物质，NGF在有机相（乙腈或者甲醇）的条件下会发生不可逆的生物活性变性，因此本文考虑采用离子交换液相色谱方法对NGF进行离子交换模式下的分离，在缓冲液的条件下保持了NGF的生物活性，使分析的过程更接近生物体液环境，同时考察了不同的pH条件对NGF分离的影响。各种不同分离方法色谱条件见表2-16、2-17，各分离模式下柱温均为30 ℃，进样量10 µL，检测波长280nm。分析图谱见图2-22到2-24。

（1）反相色谱条件：色谱柱：Acclaim300 C18，3 µm，3×150 mm， P/N：063684流动相：A：0.1%TFA超纯水； B：0.1%TFA乙腈；流速：0.50 mL/min梯度洗脱见表2-16：

（2）体积排阻色谱条件：色谱柱：Mab Pac SEC-1，5 µm，4.0×300 mm， P/N：074696流动相：50 mmol/L磷酸钠缓冲液pH=6.8和 0.3 mol/L的NaCl的混合溶液流速：0.20 mL/min（3）离子交换色谱条件：色谱柱：MAb Pac SCX-10，10 µm，4.0×250 mm， P/N：074625流动相：A：Tris缓冲液pH=7.2， B：Tris缓冲液加0.5mol/L的NaCl，pH=7.2；流速：1.0 mL/min梯度洗脱条件见表2-17：

本实验分别采用反相、体积排阻和离子交换的色谱方法分离了NGF（神经生长因子）。反相色谱条件测定选择了适于测定蛋白成分的孔径为300Å的色谱柱；体积排阻色谱采用MabPac SEC-1柱同时进样的还有牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白和细胞色素C，由图2-23可知，客户提供NGF样品的色谱峰与细胞色素C（MW=12KDa）的保留时间比较接近，因此其分子量可能为13-14KDa，是由118个氨基酸构成的单链，而没有形成二聚体。在体积排阻的色谱图上可以看到除了主峰，基本没有小杂峰，所以可以认为NGF样品中没有小片段的杂蛋白的影响。采用离子交换色谱方法分离NGF时，色谱柱和流动相的pH选择对样品的影响较大，而且之前鲜有采用离子交换的方法分离NGF的报道。根据NGF（二聚体）的pI约为9.3，因此考虑采用MAbPac SCX-10阳离子交换的色谱柱对其进行分析，改变了不同的梯度条件，但在流动相pH为5.6和6.5的条件，NGF在色谱柱基本没有保留，很快就出峰，说明在此pH条件下，NGF蛋白整体可能呈电中性或者带负电荷，导致其在阳离子色谱柱上没有保留。后将流动相pH分别调节到7.1、7.2和7.3，比较了不同的结果。将pH调节为7.3时，改变不同的梯度条件，NGF还是为一个峰，而前面的小杂峰能够较好分离。因此流动相的pH对NGF分离的影响比较大，能够将NGF样品中具有电荷差异的样品进行分离。