Folin-酚试剂法（Lowry法）测定蛋白质含量

一、实验原理

  蛋白质含有两个以上的肽键（—CO—NH）,因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与CU2+  形成络合物。Folin-酚试剂反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂（磷钼酸-钨酸试剂）,蛋白质-铜络合物能还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。

   本法的优点是操作简便、灵敏度高、较此外吸收法灵敏10~20倍，较双缩脲法灵敏100倍，反应约在15min内有zui大显色，并至少可稳定几小时。其不足之处是此反应受多种因素干扰。对双缩脲反应发生干扰的基团，Tris.HCL缓冲剂以及蔗糖、硫酸铵、巯基化合物，酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。在测试时应排队干扰因素或做空白实验消除。含硫酸铵的溶液只需加浓Na2CO3-NaOH溶液即可显色测定。若样品酸度较高，显色后色浅，则必须将Na2CO3-NaOH溶液的浓度提高1~2倍。

   本法可测定范围是25~250µg蛋白质。          

二、实验用品

（一）器材

 （1）722型分光光度计。

     （2）恒温水浴锅。

     （3）试管及试管架。

     （4）0.5ml，1ml及5ml移液管

• 试剂

   （1）试剂甲。

   （A）4%Na2CO3溶液；

   （B）0.2mol/LNaOH溶液；

   （C）2%酒石酸钾钠溶液（或酒石酸钾、酒石酸钠）；

   （D）1% CuSO4.5H2O溶液；

     临用前将（A）:（B）:（C）:（D）=50:50:1:1(体积比)混合，此混合液即为试剂甲。混合后的溶液1d内有效。

（2） Folin-酚试剂(试剂乙)：在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠（Na2WO4.2H2O），25g钼酸钠（（Na2MoO4.2H2O），及700ml蒸馏水，50ml 85%磷酸，100ml浓盐酸充分混合，烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出，接上回流冷凝管以文火回流10h。回流结束后，加入150g硫酸锂（LiSO4）,50m重蒸水及数滴液溴，开口继续沸腾15min，以除去多余的溴。冷却后溶液呈金黄色（如果仍呈绿色，须再重复滴加溴水的步骤），定容至1L，过滤，滤液置棕色瓶中保存，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸数分钟，恢复原色仍可继续使用。使用时用标准NaOH滴定酸度，以酚酞为指示剂。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度使用，即为Folin-酚试剂。

（3）标准蛋白质溶液：可用结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，再根据其纯度配制成500µg蛋白/ml溶液。

（三）材料

     血清使用前稀释100倍或约含20~250µg蛋白/ml溶液。

三、实验程序

    一、操作方法

 1.蛋白浓度标准曲线制作 

   取14支试管，分两组按表9-1平行操作。

绘制标准曲线：以OD650值为纵坐标，标准蛋白量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

2.样品溶液蛋白质浓度测定

  取6支试管，分两组，按表9-2平行操作。

3、计算