考马斯亮蓝染色测定蛋白质含量

一、实验原理

考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）测定蛋白含量存在着两种不同颜色形式，红色和蓝色。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变蓝色形式，zui大光吸收由465nm变成595nm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law），因此可以通过测定染料在595nm处吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。本法测定范围为10~100µg蛋白质。

由于该法简单、迅速、干扰物质少、重复性好、灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量测定。

二、实验用品

(一)器材

    (1) 722分光光度计。

    (2) 微量进样器。

    (3) 移液管（0.1ml及5ml）。

    (4) 试管及试管架。  

(二 )、试剂

     (1)标准蛋白质溶液：结晶牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定氮法或按牛血清白蛋白OD1%1cm=6.6测定蛋白质含量，再用0.15mol/L NaCl配制成1mg/ml蛋白质溶液。

     (2)考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。zui终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）磷酸。

    (三)材料

         末知蛋白质溶液，要求蛋白质浓度范围为0.1~5mg/ml，若浓度过度时，需用0.15mol/LNaCl溶液适当稀释。 

三、实验程序

  （一）操作方法

   1.标准法制作标准曲线

    取14支试管，分两组按表1-1平行操作。

以OD595为纵坐标,标准蛋白为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

 2.微量法制作标准曲线

    取12支试管，分两组按表1-2平行操作。

3.末知样品蛋白质浓度的测定 

  测定方法同上，取合适的末知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内，根据所测定的OD595值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出末知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。