三维多细胞类球体（肿瘤球、微球、类器官）可以帮助我们在临床前药物筛选阶段更好地预测多种候选药物的潜在作用。但是，相较于二维单层培养细胞，采用三维培养细胞模型系统进行检测分析则更具挑战性。

一起来看看珀金埃尔默是如何分析3D微组织球三维体积与分区的吧！

3D微组织球的制备和成像过程

使用 CellCarrier Spheroid ULA 96 孔微孔板制备细胞球

在CellCarrier Spheroid表面极低吸附力96孔微孔板（珀金埃尔默公司，货号6055330）中接种 HeLa 细胞，细胞浓度分别为1.25E3、2.5E3与5E3。48小时后，以3.7%甲醇固定，再用DRAQ5™染料对胞核染色。如前文所述，用磷酸化组蛋白H3抗体（西格玛奥德里奇公司，货号H9908）和Alexa 546二抗体（美国生命技术公司，货号A11081）联合标记有丝分裂细胞。为达到快速成像的需求，本实验应用长工作距离物镜，使用表面低吸附力的U形96孔板直接成像。对于高分辨率深度成像试验，本实验将细胞球转入兼容高质量成像CellCarrier 384孔超微孔板（珀金埃尔默公司，货号6057300），然后利用ScaleA2试剂进行透明化处理。

“预扫描（PreciScan）”功能大大缩短图像采集时间并减小数据量

研究人员利用Harmony软件的“预扫描（PreciScan）”功能扫描拍摄所有细胞球的图像。“预扫描（PreciScan）”是一项智能图像采集功能，它可以智能识别确定各孔内目标细胞的x/y坐标位置。通过低倍预扫描、智能联机分析和高倍再扫描，生成目标细胞的高分辨率图像。再扫描可以包含z-stack多层扫描和 / 或时间序列扫描。“预扫描（PreciScan）”功能有效节省了测量和分析时间并减小了数据储存空间（例如，使用20x物镜对在384孔微孔板内培养的细胞球进行观察分析时，预扫描可帮助减少25倍的分析时间和数据储存空间；而使用40x物镜观察时，可减少100倍的分析时间和数据储存空间），Operetta CLS与Opera Phenix系统都配置有这一功能。

利用水浸物镜与光透明化技术优化成像深度

使用水浸物镜，大大提高了成像质量，特别是提升了Z轴分辨率。此外，光透明化处理进一步改善了成像深度。光透明化处理不仅提高了样品内指标的均一性，而且减少了光散射和光学像差。在此基础上，采用长波长染色（如可行）也有利于减少光散射并提高透光率，使更多的激光照射在3D样品上。因此，可显著提升成像深度和信号检测效率。

3D微组织球重构与分析

生成三维或 XYZ 轴图像

生成三维样品的 XYZ 轴或三维图像；

在三维空间中变换样品图像——旋转、缩放或平移；

导出视频——三维重建或涵盖多层平面视图的视频。

定位细胞球与胞核

使用“定位图像区域（Find Image Region）”功能定位整个细胞球；

采用局部光强阈值进行 Z 轴光衰减补偿；

选用一种“定位胞核（Find Nuclei）”方法——专门用于 3D 图像胞核分割。

计算细胞球与胞核三维指标

使用“计算形态特性参数（Calculate Morphology Properties）”工具分析细胞球和球体内单细胞的三维形态特征。

定位有丝分裂细胞

使用“定位胞核（Find Nuclei）”功能，根据局部光强阈值定位有丝分裂、 pHH3 阳性细胞；

使用“裁剪区（Clip Box）”功能生成剖视图，从内部（右侧）观察细胞球。

使用“裁剪区（Clip Box）”工具生成剖视图

进行细胞分区，分析有丝分裂细胞分布情况

计算出每个胞核到细胞球边界的短距离；

使用“选择区域”和“选择细胞群”功能，将胞核分成不同区域。可随意调整区域宽度；

分析每个区域有丝分裂细胞数量和空间分布差异，得到各种不同的分析数据（例如，细胞形态参数）。

使用“裁剪区（Clip Box）”工具生成剖视图

基于Harmony4.8软件的整体成像细胞球三维分析方法我们可以检测到细胞球整体的形态学特征和细胞球同心区单细胞特性。采用DRAQ5™染料（红色）和pHH3抗体（橙色）标记细胞球，然后用ScaleA2试剂进行光透明化处理5天。使用Opera Phenix或Operetta CLS系统装配的20x水浸物镜（数值孔径1.0）和间距为1µm的 z-stack模块（z轴扫描高度：300µm）记录共聚焦三维图像。Opera Phenix系统的3D成像质量更佳。经实验发现，Operetta CLS系统在被测HeLa细胞球的成像深度和胞核检测性能方面与之不相上下。此处第4和第5步骤操作仅以Opera Phenix系统成像展示，Operetta CLS系统成像效果与之相当。

参考文献

1. Kriston-Vizi, J., Flotow, H. (2017). Getting the whole picture: high content screening using three-dimensional cellular model systems and whole animal assays. Cytometry, 91: 152–159. doi:10.1002/cyto.a.22907

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3. Smyrek, I., Stelzer, EH. (2017) Quantitative three-dimensional evaluation of immunofluorescence staining for large whole mount spheroids with light sheet microscopy. Biomed Opt Express, 8(2): 484-499. doi: 10.1364/ BOE.8.000484

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7. Boettcher, K., Schreiner, A. (2016). The benefits of automated water immersion lenses for high-content screening. PerkinElmer Technical Note.

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