病毒变异vs抗病毒药物

病毒是一种以DNA或RNA为遗传物质，无独立营养代谢系统，需寄生于宿主内，进行复制和生存的类生物体。病毒在自然界内与宿主共生的过程中，一些病毒可逃脱宿主免疫防御系统，导致宿主发病致死。病毒遗传物质突变几率非常高，可帮助病毒逃脱不断升级的宿主免疫系统。根据病毒进化论学说，病毒发展史要远超过人类进化史，相比之下，人类对病毒知之甚少。随着分子细胞生物学的发展，目前发现病毒种类7000多种，其中可感染人类的病毒有300多种。病毒感染类疾病占传染类疾病的3/4，严重威胁人类健康。从上个世纪60年代开始，已有广谱类的抗病毒药物出现，但由于病毒突变速度非常快，随后陆续产生病毒耐药性和副作用，导致对病毒类感染疾病无特异性有效药物进行临床治疗。

瑞德西韦——人民的希望？

2020年伊始，COVID-2019肆虐，开发特异性抗新冠病毒药物迫在眉睫。2月1日《新英格兰杂志》发表论文中，报道美国第一例新冠肺炎患者病情恶化后，经瑞德西韦(Remdesivir/GS-5734)静脉注射同情用药后病情好转^[1]。2月6日，瑞德西韦“双盲临床实验”在武汉市金银潭医院、市肺科医院和协和医院等入组761例患者进行临床评价^[2]。“人民的希望”——瑞德西韦抗新冠肺炎临床疗效，需等至4月底揭晓谜底。

瑞德西韦是由一直致力于抗病毒领域的吉利德科学公司研发（抗流感药物奥司他韦，商品名达菲，早也由吉利德研发，后卖给罗氏进行销售）。2013-2016年（西非）和2018-2019年（刚果）埃博拉病毒肆虐期间，各大制药公司掷重金进行抗埃博拉病毒药物研发。由美国陆军传染病医学研究所，吉利德科学公司，美国CDC和波士顿大学医学院四家业内实验室联合进行的瑞德西韦抗埃博拉病毒临床前药效学研究，于2016年发表在《自然》杂志^[3]。

瑞德西韦分子机制——前药(Prodrug)

三磷酸代谢物有效制止RdRp酶活性

RNA依赖型RNA聚合酶(RNA-dependent RNA-polymerases, RdRp)为广谱的抗病毒药物开发靶点，目前以RdRp为靶点的抗冠状病毒药物多为核苷类似物或RNA干扰类^[4]。瑞德西韦以前药(Prodrug)形式进入细胞后，通过三步转化为三磷酸代谢物NTP，NTP和天然ATP竞争结合病毒RdRp，插入RNA合成链中，引起病毒RNA合成终止，并抑制RdRp酶活性（下图a）^[3]。

瑞德西韦结构上的1‘-氰基，一方面针对RdRp酶提供更好的针对ATP竞争的结合活性，另一方面针对病毒RdRp酶提供了比人源RNA聚合酶II和人源线粒体RNA聚合酶(h-mtRNAP)更好的选择性抑制。在Hela细胞水平，瑞德西韦对两种埃博拉病毒和另外三种病毒都有显著浓度依赖型抑制（下图c）；且在分子水平，瑞德西韦活性分子NTP能选择性抑制病毒RdRp酶活性（下图e蓝色），而对人源RNA聚合酶II（下图e黑色）和线粒体RNA聚合酶（下图e红色）无明显抑制作用^[3]。

瑞德西韦细胞活性——高效选择性

抑制病毒在细胞内复制

研究人员又通过进一步的细胞学实验，分别在不同的细胞模型上评价了瑞德西韦(GS-5734)对埃博拉病毒和其他RNA病毒的抗病毒活性。数据显示，瑞德西韦可在五种细胞模型，包括原代巨噬细胞上有效抑制埃博拉活性；并对呼吸道感染病毒，如RSV和MERS，以及出血热感染病毒，如JUNV和LASV病毒有一定抑制作用；但对其他病毒如CHIV，VEEV和HIV-1，无明显抑制（下表）^[3]。

2019年，在《柳叶刀传染病》杂志报道，美国CDC科研人员建立的Zoanthus绿色荧光蛋白(ZsG)标记的埃博拉病毒体外细胞表型快速评价方法（下图左），再次验证了瑞德西韦可在低浓度抑制两个品系(Ituri/Makona)的埃博拉病毒复制，并对细胞活性无明显影响（下图右）。对Ituri品系埃博拉病毒，EC50为12nm，SI(selectivity index,SI)为303倍；对Makona品系埃博拉病毒，EC50为13nm，SI为279倍^[5]。

 瑞德西韦体内药效——快速扩散至病灶区，

提高模式动物存活率

在恒河猴(rhesus monkeys)动物模型上，按10mg/kg计量静脉注射给药后，检测健康恒河猴体内瑞德西韦(下图a黑色) 及其代谢物，丙氨酸代谢物（下图a红色）,  单磷酸代谢物Nuc（下图a蓝色）和三磷酸代谢物NTP（下图a绿色），在不同时间点的血药浓度。数据显示瑞德西韦前药在体内两个小时内达到峰值，随后很快被清除；而其三磷酸活性代谢物NTP在体内，特别是外周血单核细胞(PBMCs)内，可在更长的时间内维持高血药浓度。通过同位素14C标记瑞德西韦药物后，进一步研究药物在体内分部发现，药物可快速到达睾丸、附睾、眼睛和脑部（下图b）^[3]。

通过病毒暴露动物模型实验，瑞德西韦通过静脉注射给药后，可显著提高恒河猴实验动物的存活率，特别是在病毒暴露3天后按10mg/kg计量的给药组，其28天后存活率和空白对照组同样可达100%（下图d），且通过核酸定量方法进一步验证，给药组体内的病毒RNA拷贝数与空白对照组相比得到明显抑制（下图e）^[3]。

 瑞德西韦抗病毒药物机制总结

瑞德西韦以RdRp酶为药物靶点，在广谱抗病毒核苷类似物抑制剂中脱颖而出，主要归因于以下三点：1) 对其药物靶点RdRp酶，比其天然底物ATP有更高的竞争亲和性；2）在体外细胞水平，可高效选择性的抑制RNA病毒在细胞内复制，并无明显细胞毒性。3）在体内动物水平，有良好的药代学基础，其活性代谢物NTP可快速扩散至病灶，抑制体内RNA复制，提高病毒暴露后模式动物存活率。

抗病毒药物实验设计及仪器&试剂摘录列表^[3，5]

“工欲善其事，必先利其器”。在以上瑞德西韦抗病毒药物研发实验设计及检测过程中，珀金埃尔默在每一个环节都给一线的科学家们提供了高效的“实验武器”：经典的同位素标记技术，准确分析RdRp活性和药物组织分布；业内金标准EnVision多模式读板仪和高内涵成像表型分析平台Opera/Operetta，快速进行细胞内病毒感染和药物毒性评价；自动化NGS文库制备工作站Sciclone G3，加速病毒基因组快速分析。

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参考文献

1.First Case of 2019 Novel Coronavirus in the United States. NEJM Jan 2020.

2.http://www.wuhan.gov.cn/2019_web/whyw/202002/t20200207_304511.html

3.Therapeutic efficacy of the small molecule GS-5734 against Ebola virus in rhesus monkeys.  NatureMarch  2016.

4.Coronaviruses — drug discovery and therapeutic options.  NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY May 2016

5.Characterisation of infectious Ebola virus from the ongoing outbreak to guide response activities in the Democratic Republic of the Congo: a phylogenetic and in vitro analysis. The Lancet Infectious Diseases July 2019