带超声清洗的液相色谱自动进样系统--减少样品残留的新方法

摘要：随着样品浓度的降低，液相色谱进样时的样品残留问题越来越严重。尽管几个生产厂家已试图解决这个问题，但是效果却不能令人满意。超声清洁技术是实验室中用于玻璃器皿清洗的常规手段，本文介绍一种将超声清洗装置安装到液相色谱自动进样器上以消除样品残留的方法。

Reduced Carryover Using an HPLC Sample Injection System With
Ultrasonic Cleaning

Yuki Togashi, Kazuhiko Mibayashi, Masashi Mita, Tsuneaki Kaneko, and Osamu Shirota

Abstract:Sample carryover in HPLC becomes a growing problem as sample concentration decreases. Although several procedures have been discussed to solve this problem, none have proved to be truly satisfactory. Ultrasonic cleaning is routine in many laboratories for cleaning glassware, and this paper describes an attempt to install an ultrasonic cleaner onto an HPLC autosampler.

随着质谱联（MS）用技术接口的发展，液相色谱的检测灵敏度近年来得到了显著的提高。结果导致前一次进样过程造成的样品残留或记忆效应对分析造成的影响越来越严重。尤其是未知样品的浓度差异很大的药物动力学和临床分析领域中，这种影响表现得更为明显。尽管人们提出了一些解决方法，如先运行低浓度的样品、在两次分析间歇进行一次空白实验、配制适合的清洗溶液^[1~3]，但均不能很好地解决样品残留问题。

我们以前介绍了一种基于流路切换和多重清洗液的自动进样器，它具有四种不同的自清洗功能^[4]。尽管该设备对于吸附能力强的化合物非常适用，但是为了得到*去残留效果，每次运行结束后都必须对设备进行长时间的清洗，不利于分析化学高通量的发展趋势。

超声清洗技术能够使物质在材料表面迅速扩散，而不依赖物质的自发溶解过程。目前，该技术在很多领域得到了广泛的应用，如实验室玻璃器皿的清洗、生物样品的分散溶解以及工业硅晶片的清洗等等。但超声技术在加速溶解、声音污染和空化现象等方面仍存在争议^[5]。

本文介绍了一种配有超声清洗装置的液相色谱自动进样器。利用液相色谱- 质谱联用系统，研究了自动进样器进样部分的清洗速度、效率和残留量。

1 实验部分

1.1 试剂

流动相所有的有机试剂均购自Nacalai Tesque （Kyoto, Japan）公司。实验用水由Milli- Q 系统（Nihon Millipore Kogyo, Tokyo, Japan）制得。双氯苯双胍己烷、利血平和阿普唑仑均购自Sigma-Aldrich （Tokyo, Japan）公司。

1.2 仪器

液相色谱系统采用NANO-SPACE 系列（Shiseido, Tokyo, Japan）的部件组成，包括3133 型高通量自动进样器、3004 型柱温箱、3001 型惰性泵和3017 UV6000LP 型二极管阵列检测器。仪器的控制和数据采集系统是Ezchrom Elite 软件（Shiseido）。在液相色谱- 质谱联用系统中使用的质谱仪器为配有电喷雾接口的LCQ Duo 质谱仪（Therm o Electron Japan, Tokyo, Japan）。

1.3 超声清洗/样品进样装置

本研究中使用的超声清洗装置（已集成到自动进样器中）如图1 所示。它由一个振荡器和一块有三个孔的不锈钢块组成。这三个孔分别具有预清洗、排液和超声清洗的功能。整个样品进样装置的系统示意图如图2 所示。在样品运行过程中，进样针被用作流动相流路系统的一部分。在吸入样品溶液后，进样针浸入到预清洗孔中约1.5s。在进行溶剂替换操作后，再移动到超声清洗孔中。清洗过程中，振荡器振荡10s。清洗结束后，进样针插入注射孔，开始色谱分析过程。

1.4 残留率计算

残留率（%）是残留峰与已知进样峰（已知的大进样量，如2.4 μg）的比值。残留峰可以通过根据一定浓度范围内的标准曲线计算空白实验中的峰来计算。

1.5 液相色谱和液相色谱-质谱条件

1.5.1 双氯苯双胍己烷的液相色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK C18 MG 5μ m （Shiseido） （2 mm i.d.× 150mm）；流动相：水/ 乙腈（55/45,v/v），含100mmol /L NaClO₄和10mmol/ L NH₄H₂PO₄（pH 2.6） ；流速：0.2mL/ min；柱温箱温度：40℃；进样体积：2μL；紫外检测波长：260nm。1.5.2 利血平的液相色谱- 质谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK C18 MG 5 μm （2 mm i.d.× 35mm） ；流动相：水/ 乙腈（60/40,v/v），含有2mmol/L CH₃COONH₄和0.1% HCOOH；流速：0.2mL/min；柱温箱温度：40℃；进样体积：2 μL；检测器：LCQ Duo 质谱，正离子选择性离子扫描（SIM），相对分子质量范围609~610。

 1.5.3 阿普唑仑的液相色谱- 质谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK C18 MG 5 μm （2 mm i.d.× 150mm） ；流动相：含有0.1% 三氟乙酸的水/乙腈（40/60，v/v）；流速：0.2mL/min；柱温箱温度：40℃；进样体积：20 μL；检测器：LCQ Duo 质谱，采用选择反应监测扫描（SRM）/MS-MS 模式，同时扫描母离子和子离子碎片峰，相对分子质量范围分别是309 和280.5~281.5。

 2 结果与讨论

所有的商品化液相色谱仪器都存在样品残留或记忆效应，残留量取决于样品的性质和所用的色谱条件。在很多应用研究，尤其在药代动力学研究中，定量曲线的范围从亚纳克级到微克级/ 毫升，样品残留会对分析结果造成很大的影响。虽然引起样品残留的原因很多，但是自动进样器的影响是重大的。在自动进样器中，样品的浓度是zui原始的浓度。色谱的分离过程可以看作是一种稀释过程，部分样品可能会吸附到自动进样器的内表面。尽管药厂里分析化学家们使用的大部分化合物都是保密的，但依经验而言，强疏水性和碱性的化合物容易产生较严重的样品残留问题。

双氯苯双胍己烷（见图3）是一种抗微生物剂，容易产生样品残留问题。图4显示了双氯苯双胍己烷的样品残留色谱图。根据进样量（1200 μg/mL × 2 μL, 相当于2.4μg）计算得到残留率为0.058%。其清洗过程只是将进样针头插入预冲洗孔中清洗1.5s。因此残留在进样针外壁的样品与进样器接触时可能会造成污染。由于自动进样器作为流动相流路的一部分，进样针的内壁不会造成样品的残留。

图5 显示了有超声清洗和无超声清洗时双氯苯双胍己烷样品残留结果的比较图。超声清洗的运行过程如下：从样品瓶中吸取样品溶液后，样品针插入到预冲洗孔中。然后，将进样针转移到超声清洗孔中，振荡10s。经过超声清洗后，残留率降低到0.0007%。这一结果比以前我们采用其他清洗方法得到的残留率的二分之一还要低很多^[4]。

除了减少残留率，超声清洗还能显著地缩短清洗时间，而且避免了清洗液溶解性的限制。传统的进样针清洗方法是将其置于能够除去残留样品的清洗液中（见图6）。进样针外壁残留样品转移到清洗液的这一过程仅仅取决于溶解平衡和扩散过程。由于进样针外壁附近有一层滞留层，不易受流动辅助扩散（如搅拌）的影响，因此表层的溶解是整个过程的决速步骤。

相反，一旦超声振荡产生了驻波，所有的分子都会开始振荡。通过与溶剂分子的碰撞，进样针外壁残留的化合物很快扩散到清洗液中。虽然超声清洗的机理细节还没有研究清楚，但是该技术的有效性已经被工业应用的许多领域所证实。

图7 显示了超声清洗的效果。将超声清洗孔从自动进样器上卸下来，用市售的唇膏和水来验证其效果。唇膏的主要成分是疏水性组分，例如染料、油和油脂。如果唇膏残留到进样针外壁（见图7a），那么只能用有机溶剂才能将其除去；而用流水不能达到目的（见图7b）。然而在超声清洗10s 的情况下，即使水也能洗去附着的唇膏残留物（如图7c 和7d）。显而易见， 在振荡作用下，进样针外壁的残留物被强制解散到周围的水层中。在液相色谱试验中残留物的量比该演示中的残留量小得多，因此这一现象很难用肉眼观察到。跟预想的一样，超声清洗法不同于传统的清洗方法。

针对各种物质，我们将自动进样器应用到液相色谱- 质谱联用系统中。利血平，一种安定类药物，由于其响应值高，经常作为电喷雾质谱的相对分子质量校正标准品。我们进行了利血平残留率的实验（见图8）。在本研究所用的条件下，经过超声清洗后没有观察到残留物的色谱峰。整个过程所需的时间，包括进样和进样针的清洗，不超过1min。

我们用同样的方法考察了一种抗抑郁剂--阿普唑仑的残留率。一些仪器生产厂家常用该物质来评价产品的样品残留参数。在相同的色谱条件下，我们得到了令人满意的结果（见图9）。即使将进样量提高10 倍，也没有观察到残留样品的色谱峰（见图10）。

结论

超声清洗法有效地消除了液相色谱分析中的样品残留峰问题。该方法不同于自动进样器以前所采用的方法。利用该方法，残留样品的色谱峰的强度可大大降低。

References

1.       Dolan JW. LC.GC 2001;19（2）:164.

2.       Dolan JW. LC.GC 2001;19（3）:290.

3.       Dolan JW. LC.GC 2001;19（2）:1050.

4.       Sh ir ota O . Pro ce edi ng s 200 3 Pit ts bu rg Conference, Orlando, FL.

5.       Cheeke JDN. Fundamentals and applications of ultrasonic waves. Boca Raton, FL: CRC Press, 2002.

6.       Togashi Y, Shirota O. Japanese patent application, 2004.