各位读者好，今天解读的文章是10月最新发表在《Nature》（Q1，IF69.5）上的，题为‘CRISPR–Cas9 screens reveal regulators of ageing in neural stem cells’，中文译名：CRISPR–Cas9 筛选揭示神经干细胞衰老调控因子。‍

我们知道神经干细胞（NSCs）是大脑中的一类重要细胞，它们在成年期负责新神经元的生成和脑损伤后的组织修复。然而，随着年龄的增长，NSCs的功能会逐渐下降，导致新神经元产生减少和损伤后再生能力下降。

尽管过去已有研究通过遗传干预改善了老年大脑的功能，但对老年NSCs的系统性功能测试尚未进行。因此，本篇文章旨在通过开发体外和体内高通量CRISPR–Cas9筛选平台，系统地鉴定能够促进老年小鼠NSCs激活的基因敲除，这些研究不仅为理解老年NSCs的功能衰退提供了新的分子机制，也为开发抗衰老干预措施提供了潜在的靶点和新措施

研究人员首先在体外建立了基于CRISPR–Cas9的基因敲除筛选平台，通过在年轻和老年小鼠的NSCs原代培养中进行全基因组筛选，鉴定出能够特异性恢复老年NSCs激活的基因敲除。接着，研究人员在体内建立CRISPR–Cas9筛选平台，通过在老年小鼠大脑中进行基因敲除，鉴定出能够促进NSCs激活和新神经元产生的基因。

体外筛选平台的建立

1. sgRNA的设计：研究人员首先根据目标基因序列设计特定的单链引导RNA（sgRNA）。

2. 构建编辑载体：将设计好的sgRNA序列克隆到表达Cas9蛋白的质粒或病毒载体中。

3. 细胞转染：将构建好的CRISPR–Cas9载体导入目标细胞，如神经干细胞。

4. 筛选和验证：通过抗生素筛选、PCR和测序等分子生物学方法，筛选获得基因编辑效果的细胞，并验证基因敲除效果。

5.功能分析：研究敲除基因后细胞的表型变化和功能影响，如细胞增殖、分化、迁移等。

体内筛选平台的建立

1.立体定位脑内注射：研究人员通过立体定位手术将携带sgRNA的慢病毒直接注入老年Cas9小鼠的侧脑室，靠近神经干细胞的微环境（SVZ）。

2.基因敲除效果的验证：几周后，收集小鼠的嗅球（OB），通过基因组测序分析sgRNA的富集情况，以评估基因敲除的效果。

3.免疫荧光成像：对注射后的脑组织进行免疫荧光染色，以验证基因敲除对神经干细胞激活和神经发生的影响。

4. 基因敲除效率的评估：通过流式细胞术（FACS）和Western Blot等技术，评估基因敲除的效率和特异性。

这些平台的建立为研究人员提供了强大的工具，以系统地研究老年神经干细胞的衰老机制，并为开发抗衰老干预措施提供了新的策略。通过这些技术，研究人员能够精确地敲除特定的基因，并评估这些基因敲除对细胞功能的影响，从而揭示调控神经干细胞衰老的关键分子途径。

体外筛选平台的建立与基因靶点鉴定

研究人员通过体外筛选平台，对年轻和老年NSCs进行了全基因组CRISPR–Cas9筛选。通过高通量筛选，研究者发现了300多个基因靶点，这些靶点敲除能够特异性地恢复老年NSCs的激活（图1a-c）。这些基因靶点主要涉及纤毛组织和葡萄糖摄取过程，提示这些生物学过程可能在NSCs的衰老中发挥重要作用。

体内筛选平台的建立与基因敲除的鉴定

为了验证体外筛选结果的体内效应，研究者还建立了一个体内CRISPR–Cas9筛选平台。通过在老年小鼠大脑中进行基因敲除，研究者鉴定出24个基因靶点，这些靶点能够促进NSCs的激活和新神经元的产生（图2a-d）。这些结果表明，通过CRISPR–Cas9技术在体内进行基因敲除是一种有效的策略，可以用于研究老年NSCs的功能衰退。

Slc2a4基因敲除对老年NSCs功能的影响

在所有鉴定出的基因敲除的靶点中，Slc2a4基因（编码GLUT4葡萄糖转运蛋白）的敲除是提高老年NSCs功能的zui有效干预措施之一（图3a-d）。研究者发现，随着年龄的增长，NSCs中的葡萄糖摄取增加，而短暂的葡萄糖饥饿可以恢复老年NSCs的激活能力。因此，葡萄糖摄取的增加，可能会加速随年龄增长而导致的NSCs激活能力的下降。

老年NSCs的高葡萄糖摄取及其对NSC激活的影响

研究者进一步分析了老年NSCs的葡萄糖摄取特性。通过体外实验，研究者发现老年qNSCs和aNSCs的葡萄糖摄取是年轻对照组的两倍（图4a-f），说明通过遗传或通过葡萄糖限制来逆转这种增加，可以促进老年NSCs的激活。这些结果表明，老年qNSCs处于高葡萄糖摄取状态，这可能是由于随着年龄的增长GLUT4表达的增加。然而，这种状态可以通过遗传或葡萄糖限制干预来逆转，以促进老年qNSCs的激活。