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冰冻切片应用SP免疫组化染色法的体会

　链霉菌亲生物素蛋白-过氧化物酶连接法（streptavidin×idaseConjugatedmethodsp法）［1、2］是美国Zymed公司于1986年*的免疫组化方法。我们用sp法研究了sars冠状病毒（sars-cov）s蛋白的功能性受体血管紧张素转换酶2（ace2）在大鼠内脏尤其在胰腺内外分泌腺的表达，效果满意。现结合我们所做的实验对免疫组化程序中的一些主要技术问题总结如下。 

　　1、材料和方法

1.1 实验动物

250g左右成年健康雄性Wistar大鼠（20只），4周龄，中国医学*动物所提供。

1.2 主要试剂

羊抗鼠ace2多克隆抗体（santacruse公司），sp试剂盒（美国Zymed公司），二氨基联苯胺（daB），0.01mmol/l，ph7.4磷酸缓冲液（pBs），胎牛血清白蛋白（Bsa）。

1.3 实验方法

麻醉动物取内脏组织制作冰冻切片，用含0.1%Bsa的pBs冲洗震荡（以下所用pBs均含0.1%Bsa），10min×2，3%H2O2去离子水避光孵育20min，蒸馏水充分冲洗后摇床震荡15min，再用pBs浸泡5min。先后滴加20%-30%鸡蛋清液、封闭用正常兔血清工作液及1%Bsa，各室温孵育20min，倾去，勿洗。滴加1∶50稀释的一抗，4℃隔夜，pBs充分冲洗震荡，10min×6，滴加二抗（生物素标记的兔抗山羊igg工作液），37℃温箱孵育15min，pBs充分冲洗震荡，10min×6，滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃温箱孵育15min，pBs充分冲洗震荡，10min×6。daB显色，同时在显微镜下观察显色状况，显色*后用自来水充分冲洗，苏木素复染，封片。用pBs代替一抗作为阴性对照。

　　2、体会

2.1 抗体的保存

抗体是免疫组化zui基本的试剂，因为抗体是蛋白质构成，保存或使用不当，不但会造成浪费，而且试剂变质会出现假阴性结果。对即用型试剂在4℃冰箱保存，尽量缩短滴加抗体时间，并在有效期内使用，对原装浓缩液的抗体，提倡用等量灭菌甘油混合（分装更佳，防止长时间用枪头吸取污染的可能），一般2L一个包装。抗体及s-p试剂盒均应放置低温冰箱贮存，用1支取1支，一次用不完的抗体保存在4℃冰箱内（不超过1个月），而不要放在冰格室，因为在那里抗体会很快结冰，再次使用时又要融解，这样反复冻融，抗体效价会急剧下降。

2.2 非特异性染色在免疫组化的实际应用过程中常会遇到非特异性染色这一问题，对实验结果的判定造成严重影响。

2.2.1 所选择的抗体是否符合实验要求

因抗原不纯、标本片中含有与靶抗原相似的抗原决定簇等原因造成的非特异性染色只能通过采用高纯度、价的抗体或针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。检查二抗与标本的内源性组织蛋白是否有交叉反应。抗体稀释应遵循“现用现配”的原则，对于pBs稀释的抗体一定要当天使用。

2.2.2 内源性过氧化物酶和生物素是否充分封闭

3%H2O2去离子水避光孵育20min可以*封闭内源性过氧化物酶。

我们以大鼠内脏为研究对象，内源性生物素含量非常丰富，通过反复摸索，我们用20%-30%鸡蛋清液室温孵育20min（倾去勿洗），可以*封闭内源性生物素，得到干净的阴性片子。有报道说也可以用卵白素封闭［3］。

2.2.3 是否选择使用了正确的封闭血清

电荷吸附所造成的非特异性背景染色，我们用正常兔血清工作液及1%Bsa消除。

2.2.4 清洗是否充分

因在缓冲液中含有一定量的盐，这亦有利于减低背景着色，通常0.05mol/ltris-hcl，0.15mol/lnacl已适用于多数染色方法，我们用0.01mmol/l，ph7.4磷酸缓冲液长时间、大幅度地震荡清洗，累计清洗时间达3h，效果满意。清洗完毕后应去除清洗液，如果切片上了过多的清洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。

2.2.5 daB的使用是否正确

daB是目前显色剂，阳性着色为棕褐色，耐受化学试剂，敏感性高。我们滴加daB后在显微镜下观察显色状况，避免过染，否则背景模糊，待显色*后用自来水充分冲洗。daB的孵育时间和配制方式可以产生某些背景颜色，使用浓缩型daB试剂盒时，请严格按照说明书标明的滴加顺序操作，注意校正蒸馏水的ph值，以确保实验结果的正确性；粉剂daB溶解时，常有一些不溶性颗粒，这些颗粒须经过滤除去，否则可能沉积于切片组织上，产生斑点状着色。另外，daB保存不妥产生氧化物亦可沉积于切片上，因此需将daB保存于避光干燥处，要新鲜，现用现配，放置不超过半小时。孵育时间过长也会造成背景染色。

2.2.6 一抗的使用浓度是否过高

预实验中，将一抗的浓度定位在1∶50-1∶500之间，逐个摸索，以得到*浓度稀释比例。

2.2.7 标本染色过程中是否曾经干涸

标本干涸会造成边缘部的非特异性染色。加入试剂后一定要放入孵育盒内（特别是胰酶消化），每次滴加试剂要适量，防止孵育时间未到，试剂已挥发，出现假阳性；也不能使组织切片干涸后再加试剂，染色易出现阳性。

2.2.8 苏木素复染

经常出现过染现象，浆核蓝染过深。根据分化剂能选择性地除去染剂的原理，用0.5%的盐酸酒精分化数秒，流水冲洗1min蓝化，即清除过染的苏木素，也起到了清洁组织片的作用。

我们复染的步骤如下：苏木素（10min以上）→水→盐酸→水→氨水→酒精1→酒精2→酒精3→二甲苯→中性树胶封片。

2.3 其他

免疫组织化学染色的成功与否，除取决于试剂的质量及染色各环节的操作外，在很大程度上还取决于标本取材、固定、切片等染色前准备工作。这些准备工作如果处理不当，在随后的染色过程中往往无法补救，导致染色失败。

2.3.1 对照

每次实验都要设立对照片。如果没有对照，片子是否出现假阳性或假阴性，实验者自己都搞不清楚。阳性对照片靠积累，阴性对照我们用pBs代替一抗进行。二抗、三抗等步骤不和阴性对照片放在一起冲洗。

2.3.2 时间和温度

孵育时间和温度对提高抗原抗体的结合率，增强免疫反应有重要意义。孵育时间过短，抗原抗体结合不够充分，染色较浅。延长孵育时间，将一抗孵育于4℃隔夜；二抗、三抗在37℃孵育15min，结果表明延长孵育时间后特异性免疫反应明显增强，染色明显加深，阳性反应率也明显提高。

2.3.3 取材、固定、切片

对病变的选材应尽量避开出血及坏死部位。常用的固定剂有甲醛、戊二醛、乙醇、丙酮等。切片时所用载玻片需涂抹粘片剂，以防脱片。切片质量的好坏，直接影响染色的效果。我们采用冰冻切片，均是麻醉大鼠后立即取材、切片，都为同一个组织的连续切片，丙酮固定10min，放4℃冰箱保存，放置时间一般不超过2周。

2.3.4 抗体与抗原的匹配

使用的一抗必须和二抗匹配，这一点非常重要。比如一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；一抗是小鼠的igm抗体，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的igm二抗。

2.3.5 冲洗液与反应试剂的匹配

冲洗液必须和反应试剂匹配，溶液的ph值十分重要。

　3、讨论

链霉菌亲生物素蛋白是从一种链菌素分离出的不含糖基链的蛋白质，含有4个亚基，每个亚基有1个和生物素亲和力*的结合点。与aBc复合物不同，它仅标记过氧化物酶而本身并没有与生物素连接，生物素是直接连接在第二抗体上，故其分子量比aBc复合物小，渗透组织的能力更强、反应速度更快、敏感性更高。此外，因其本身不含糖基链，等电点为6.5，接近中性，几乎不与组织中的内源性凝集素样物质发生非特异性结合，从而产生了低背景、高放大的效果。人们对内源性过氧化物酶已有了充分认识，过氧化氢法可有效消除组织中的过氧化物酶活性，从而达到避免非特异性染色的目的，而很久以来对内源性生物素产生的影响几乎没有采取任何措施。其实，内源性生物素对免疫组化染色的影响程度远高于内源性过氧化物酶，其在组织中主要以颗粒状形式存在于胞质中，并且广泛存在于上皮源性组织，特别是腺上皮组织。免疫组化s-p法是应用生物素-卵白素或生物素与链酶卵白素检测系统，属于亲和素-生物素法之一。内源性生物素易结合后继抗体，形成亲和素（或链亲和素）-生物素复合物，导致假阳性结果，势必影响实验结果的判定。

　　免疫组化染色的成败，直接关系到实验研究的成败，免疫组化染色中一个环节注意不到，都将影响结果。这方面的研究还需要我们不断总结，才能为临床与科研提供诊断及治疗的有力依据。