在分光光度计中,将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时,便可得到与众不同波长相对应的吸收强度.如以波长(λ)为横坐标,吸收强度(A)为纵坐标,就可绘出该物质的吸收光谱曲线.利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法,称为分光光度法,也称为吸收光谱法.用紫外光源测定无色物质的方法,称为紫外分光光度法;用可见光光源测定有色物质的方法,称为可见光光度法.它们与比色法一样,都以Beer-Lambert定律为基础.
近年来,紫外及可见光分光光度分析已得到广泛的应用,它不仅可以用于物质的鉴定及结构分析,而且还可以用于某些物质含量的测定.
分光光谱技术可用于:
一、紫外及可见光分光光度法这是一种只在可见光及紫外光光谱应用范围内测量物质吸收放射线的技术,应用十分广泛.其中分光光度计可用于测量特定波长的吸收值,而比色计则是一种较简单的测量仪器,其原理是利用虑光片来测量较宽波段(如可见光中的绿光、红光或蓝光范围)的吸收值.
光吸收法则:
溶液对光的吸收有两个基本法则:
①透过溶液的光的吸收值同吸收溶质的分子数目(即溶质浓度[C])呈指数相关。
②透过溶液的光的吸收值同透过吸收溶液的路径长度l成指数相关。
这两条法则包括在比尔-朗伯关系式中.通常以入射光(Io)和出射光(I)的光密度来表示:
ε其中ε对于吸收物质及波长是一个常数,称为吸光系数或吸收系数,[C]的单位为mol/L或g/L,l的单位为ml.这一公式非常有用,因为大多数分光光度计设计为直接测量log10(Io/I)的值(A)或消光值(E)(旧教材中可能使用以废除的术语:光密度).对于遵循比尔-朗伯关系的物质,A与C呈线性关系.吸收值常用下标表示其波长,如A550表示550nm处的吸收值.透过溶液的光的比例称为透光率(T),可由出射光和入射光的比值求得.
吸收值(A)(absorbance)--由公式得出:
透光率(T)(transmittance)--通常以百分数表示:T=(I/Io)×(一)比色计比色计用于测定颜色明显,并且是溶液主要组分的待测物,如血液中的血红细胞,也可以在待测物之中加入一种试剂,使其形成有色产物(一种生色团),如用茚三酮法测定氨基酸含量.定量分析某种物质要做标准曲线,标准曲线是在测定待测样品的同时测定已知含量的物质来制成的,而不是使用比尔-朗伯关系.
光源通常为钨丝灯泡,通过一个凸透镜聚焦后产生一束平行光,平行光穿过装有溶液的玻璃样品或小池,然后透过一个有色滤光片到达光电管检测仪,检测仪产生一个同落在光电管上的光密度成正比的电势,来自于光电管的信号被放大然后传递到电流计或数字读数器.
比色计的使用:
①接通电源使仪器稳定,使用前至少要让灯预热5min；
② 选择一种同底物颜色互补的滤光器；
③调零(用空白对照调零)；
④调整灵敏度；
⑤分析样品及标准溶液；
⑥由于不同比色杯的吸光特性、杯壁厚度不同,因此为了提高度,同一试验应用同一比色杯,且在比色槽中摆放的方位相同；
⑦每次测样前清洗比色杯；
⑧经常重复测定同一溶液检验比色计的可重复性；
⑨用标准溶液绘制标准曲线。
由于大多数过滤器过滤出来的光的波带很宽,因而比色计既不能用于确定某种复合物,也无法分辨在混合液中吸收特性非常相近的两种物质.比色计所用光电管的变化系数为0.5%左右,因而不适合要求具有高度性的工作.使用这种zui简单的仪器,由于仪表上对数测量刻度单位的随意性,即使是把表上的灵敏度/刻度调节到零控点,在一个仪器上获得的值不可直接同另一台仪器上测得的值相比较,同一仪器的不同设置之间也不可直接比较.比色计对于特定波长的量化工作是不合适的.
(二)紫外光/可见光分光光度计紫外光/可见光分光光度计基本装置中采用高强度的钨灯作为光源,能够在可见光范围(400~700nm)调节.氘灯用于紫外分光光度测量(200~400nm);使用氘灯时要用石英杯,因为紫外线不能透过玻璃.
分光光度计之所以优于比色计就在于使用了一个衍射光栅将光源的复色光转换为单色平行光束.实际上从这种单色一种产生的光不是某个波长的光,而是一段窄的带宽上的光,带宽是分光光度计的一个重要特性,这是由于它决定了吸收测量中所用的波长--普通分光光度计的带宽为5~10nm,用于研究的仪器的带宽小于因为光栅夹缝的宽度影响着带宽,带宽随光栅夹缝的宽度的减少而降低,要获得特定波长下的数据,尽可能使用zui小的缝宽度.然而,减少了缝宽也会减少到达监测器的光度,降低了信/噪比.缝宽可减少的程度取决于检测/放大系统的灵敏度及稳定性于离散光的存在.
大多数UV/可见光分光光度计使用的比色杯的光穿过路径为10nm.一次性塑料杯适合于对水和乙醇溶液在可见光范围内的测量.玻璃比色杯的生产要求更加严格的标准,因而在研究中要使用玻璃比色杯,尤其当溶液的吸收值很低时(<0.1),即使盛对照液与待测样品液的比色杯在光学性质上有稍许不同,也会导致结果偏差.玻璃和塑料会吸收UV光,因此在测波长小于300nm的吸收值时要使用石英杯.
进行测量之前,比色杯要保证干净,无划痕,外表面干燥,盛液到适当高度,并放在了比色槽中的正确位置.生物样品中蛋白质和核酸可能会在玻璃/石英杯的内表面沉积,因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯内的沉淀或用1mol/L硝酸浸泡过后.腐蚀性及毒性溶液必须使用有盖子的比色杯,以防止溅出,破坏仪器.
基本分光光度计使用的光电管类似于比色计中所使用的光电管.许多情况下,当波长高于和低于550~600nm时必须使用不同的光电管,这是因为它们在可见光波长内的灵敏度不同,更精彩的仪器中所使用的是具有比光电管更高的灵敏度和稳定性的检测器.数字显示由于不易产生视觉错误和误读范围的错误,正逐渐代替指针读数.一些仪器可以直接给出所测定物质的浓度.
紫外光/可见光分光光度计的类型:
基本分光光度计只产生单束光.这种仪器首先用空白对照调到零吸收值,然后取出空白液,加入待测液,测定待测液的吸收值.也有一种双束分光光度计,有单色光源产生的光束被分为两束,一束穿过待测液,另一束穿过空白液.吸收值由一个电子线路通过对比透过待测液及空白液的出射光进行测定.双光束分光光度计减少了由于光源输出的不稳定或检测系统灵敏度的变化而导致的测量错误,这时由于待测液与对照液是同时进行测量的.记录式分光光度计是一种双束测定仪,用于记录已知波段下吸收值随时间的变化(如用于酶分析).
分光光度计的定量分析:
假如已知一种物质在某一波长下的吸光率(通常是该物质的zui大吸收值,这时灵敏度zui高),这种物质纯溶液的浓度可用比尔-朗伯关系式算出.摩尔吸光系数是指物质在1mol/L的浓度下,比色杯厚度为1cm时的吸收值.该值可以从光谱数据表中查到,也可以用实验方法通过测量一系列已知浓度的物质的吸收值来绘制一条标准曲线.这样,在所要求的浓度范围内,便可确定吸收值与浓度之间存在的线性关系,该直线的斜率即为摩尔吸光系数。
比吸光率是指物质质量溶液浓度为10g/L时,比色杯厚度为1cm时测定的吸光值.该值对于未知分子质量的物质如蛋白质核酸的测定很有用,这种情况下溶液中物质的含量以其质量表示而不用摩尔浓度表示.使用公式Log10(Io/I)=εl[C]时,比吸光率要除以10才可以得到一个以g/L为单位的浓度值。
这种简单的方法不能用于测定混合样品.在这种情况下,也许可以通过测量几个波长下的吸光度来估算每种成分的含量,如可用此方法在核酸存在下进行蛋白质含量的估算。
分光光度计的使用方法:
(1)接通电源;(2)使用前预热15min;(3)选择波长;(4)选择检测器;(5)如果可能的话,选择正确的缝宽;(6)插入适当的空白对照;(7)调解到0%的透过率;(8)将吸光值调到零;(9)分析样品;(10)每测量10个样品后,用空白对照校验零刻度;(11)检测仪器的可重复性.
