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树脂切片制作过程

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2016/11/25 15:29:40

一、实验仪器及试剂

1.器具电子天平、70℃恒温箱、玻璃制刀机、半/超薄切片机、显微镜、包埋模、制刀用的玻璃条、镊子、刀片。

 

2.试剂

 (1)固定剂FAA

 (2)脱水剂20%40%60%80%90%95%100%的乙醇;丙酮

(3)树脂Spurr树脂

(4)染色剂:1%碱性品红

二、实验步骤

1.取材和固定取样时所用的器具必须干净,刀、剪等必须锋利,在操作时尽量避免拉、锯、压等动作对组织细胞造成的机械损伤。一般样品块的大约为1立方毫米,取材完成后立即放入固定液中,真空泵抽气两到三次,每次1-2min(注意不要让固定液沸出,如抽完后液体较少,可再补加固定液)。

2.脱水:50%60%70%85%95%100%的乙醇分别浸渍固定的材料,每种浓度处理1015min

3.置换

(1)在管瓶中加入2ml无水乙醇和1ml丙酮,处理材料10min

(2)向管瓶中追加1ml丙酮,处理材料10min

(3)向管瓶中再追加2ml丙酮,处理材料10min

(4)倾倒出管瓶中的无水乙醇和丙酮混合液,加入纯丙酮3次,每次10min

4.浸透

(1)在管瓶中加入1ml丙酮,向内滴入1Spurr树脂,12h

(2)向管瓶中追加1至数滴Spurr树脂,使Spurr树脂的浓度逐渐提高,每滴加一Spurr树脂,放置12h,共滴加0.3ml左右的树脂,使树脂浓度达到25%右。

(3)用吸管吸去管瓶中0.50.8ml的丙酮和Spurr树脂的混合液,然后加入纯Spurr树脂0.5ml,使树脂浓度达到50%60%左右,23h

(4)用吸管吸去管瓶中的丙酮和Spurr树脂的混合液,加入0.50.8mlSpurr脂,23h

(5)更换新配制的Spurr树脂1ml,过

(6)重复换树脂3次,每次12h

5.包埋与聚合

(1)先将恒温箱调至温度至70℃,包埋模事前烘干置干燥器中存放。

(2)在湿度小的房间里进行包埋操作。在包埋模的中放上已浸透的材料(用牙签不损伤样品地桃)用滴管吸取新配制的Spurr树脂,并注满每个穴孔,用牙签拨样品,使样品按一定方位(有利修块、切片和观察)排列。做好记载(各穴孔中放的是什么样品

(3) 聚合:将包埋样品的包埋模放入70℃恒温箱中聚合,8h后取出置干燥器中存放。多余的树脂可放在胶囊中或放在包埋模的穴孔中同样品一同聚合。

6.修块

用锉刀或铁砂皮磨样品块,使样品稍稍暴露,使待切部位呈方形或长方形,zui后用刀片将样品块的磨面切平

7.玻璃刀的制作

用玻璃制刀机先将玻璃条制成边长为25mm的正方块,然后再将每正方块制作成2把璃制刀。

8.切片、贴片

(1)固定样品块和玻璃刀

将样品块和玻璃刀固定在半薄切片机上,玻璃刀的避样品角约为5度,切片机装样品部位平放时,玻璃刀刀口与样品块处于同一高度。调节玻璃刀前后位置,使刀口接近样品块。

 (2)荒切

开动切片机,调节进刀距离和速度,让玻璃刀荒切样品块,使样品块的切面逐渐平整光滑起来。

(3)切片

当样品块的切面平整光滑后便可正式切片。作为光镜观察用的半薄切片厚度一般控制在1-2μm左右。

(4)贴片

当切到理想切片时,用尖头镊子夹住切片,并把切片释放到滴有水滴的载玻片的水滴上,然后将载玻片放到烤片机上45℃烤片,当载玻片上的水滴被烤干时切片就被贴在载玻片上。

(5) 将碱性品红染液均匀覆盖在载玻片上,45℃烤干,随后用50%乙醇冲洗,并再次把切片烘干。

(6)封片,观察

注意:透射电镜样品固定液为2.5%戊二醛溶液

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