酶联免疫吸附法（EIASA）测定克伦特罗残留

（1）试剂和材料 以下所有试剂，除特别注明外，均为分析纯试剂；水为符合GB／T6682规定的二级水。
①盐酸克伦特罗对照品：含盐酸克伦特罗不得少于98．5％
②盐酸
③无水甲醇
④氢氧化钠
⑤磷酸二氢钾
⑥磷酸
⑦盐酸溶液 取盐酸4．2ml，加水至1000ml，即得。
⑧o．5mol／L磷酸二氢钾溶液 取磷酸二氢钾68g，加水800ml溶解并用磷酸调pH值至3．O，用水稀释至1000ml，即得。
⑨0．05mol几磷酸二氢钾溶液 取磷酸二氢钾6．88，加水800ml溶解并用磷酸调pH值至3．0，用水稀释至1000mi，即得。
a．氢氧化钠溶液 取氢氧化钠48，加水使溶解成100mi，即得。
b．盐酸克伦特罗对照品储备液（1mg／mi） 准确称取28．3mg盐酸克伦特罗对照晶至25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至25ml，一20~C以下保存，有效期1年。
⑩盐酸克伦特罗对照品工作液（10ttg／mi） 取lmg／mi储备液o．5ml到50mi量瓶中，加水至50mi，2～8~C保存，有效期1个月。
⑾盐酸克伦特罗对照溶液（100ng／m1） 取1（ug／m1工作液o．5ml到：50mi量瓶中水至50mi，2～8~C保存，有效期1个月。
⑿盐酸克伦特罗检测试剂盒（2～8~C冰箱中保存）
⒀固相萃取柱C，s：100mglml含碳量≥17％
（2）仪器和设备
①酶联免疫反应读数仪
②分析天平 精度0．00001g
③天平 精度0．01g
④冷冻离心机
⑤50mi具塞离心管
⑥匀浆机
⑦微型振荡器
⑧回旋振荡器
⑨微量移液器 单道20uL，50ul，100uL；多道50～250uL，
⑩干热浓缩器
①空气压缩机
（3）测定步骤
①试料的制备（尿）
取供试尿lml，于3000r／min离心l0min，上清液作为供试试料，直接供酶联免疫测定法测定。
取空白尿lml，于3000r／min离心l0min，上清液作为空白试料，直接供酶联免疫测定法测定。
取空白尿2ml，于3000r／min离心lOmin，上清液1．Oml添加lOOug／L的克伦特罗对照溶液20／H。作为2ug/l空白添加试料，直接供酶联免疫测定法测定。
②试料的制备（肝）
取约lOOg新鲜或冷冻后融化的空白或供试猪肝,用匀浆机以10000r／rain匀浆1-2min，使均匀呈糊状，一20~C以下冰箱中贮存备用。
取均浆后的供试肝样，作为供试试料。
取均浆后的空白肝样，作为空白试料。
取均浆后的空白肝样（1土0．05）e添加lOOng／m1的克伦特罗对照溶液20tzL作为2ng／g空白添加试料。
a：提取（肝） 取（1士o．05）z试料，置50ml离心管中；加盐酸溶液5．Omi，旋涡混匀，中速振荡1．5h；在10—15~C下以4000r／mill以上速度离心15min；上清液移人另一50ml离心管中，加入氢氧化钠溶液300gL，混匀，振荡15min；加o．5mol／l磷酸二氢钾溶液4．Omi，混匀，2—8~C放置过夜；取上述溶液于10～15~C以4000r／111113以上的速度离心15min，上清液备用。
b．净化（肝） C，，固相萃取柱依次用无水甲醇3mi、o．05mol／L磷酸二氢钾溶液2mi预洗，不使柱床干涸；将备用上清液全部过柱；用o．05mol／L磷酸二氢钾溶液2ml淋洗，挤干，弃去所有淋洗液；用无水甲醇2mi洗脱，流速控制在o．5ml／mm以下，挤干，收集洗脱液；于50～60~C下用氮气或空气缓缓吹干洗脱液；残余物用水1．Omi溶解，以4000r／mill以上的速度离心15rain，清液作为试样溶液供酶联免疫测定法测定。
③测定
a．室温应控制在19～30~C。
b．取在19—30~C放置1—2h的试剂盒，按每个标准溶液和试样溶液至少两孔计算所需酶联板条的数量，插入框架。每个微孔加入用缓冲溶液100倍稀释的抗体100~tL，封口膜封板，室温孵育30min。
c倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体。用多道移液器加水250pL到酶联板的微?L内，稍后倒出孔内液体，再将酶联板倒置在吸水纸上拍打，如此重复操作洗板3次。
d．分别吸取标准溶液、空白试料、空白添加试料和供试试料各20uL，分别放入不同微孔底中央，并在每孔内加入用缓冲溶液100倍稀释的酶结合物100~I。，在微型振荡器上混匀，用封口膜封好，室温孵育30min。
e．倒出孔内液体，将酶联板倒置在吸水纸上拍打，使孔内没有残余液体，重复洗板3次。
f．用多道移液器加入用底物缓冲溶液10倍稀释的底物100uL，室温避光孵育15min。
g．用多道移液器每孔加终止液100uL。
h．在1h内将酶联板放于酶标仪内，于450nm波长处测定吸光度值。
（4）计算 用数据分析软件对结果进行分析，绘出标准曲线，并得出试料中克伦特罗的含量。
（5）灵敏度和回收率
本方法的平均检测下限为o，ibg／k8。
本方法在1Ps／kg添加浓度水平上猪尿回收率范围为60％一120％，猪肝回收率范围为40％～120％。