内毒素

内毒素致病性

Pfeiffer于十九世纪首先提出“内毒素”一词，研究表明，内毒素在机体内作用于单核巨噬细胞产生多种细胞因子（肿瘤坏死因子TNF，白细胞介素IL，干扰素Interferon，凝血素等）。当这些因子在机体内过量时，则可导致机体出现发热、低血压、休克、多器官功能衰竭甚至死亡。

因此，人和动物的注射药物、生物制品和医疗器械的终端产品中的内毒素的检测和去除显得尤为重要。

内毒素结构

内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的一部分，其主要成分为脂多糖（LPS），经细菌细胞裂解后释放出来。LPS可以分为三个不同的结构域：特异性O链、核心寡聚糖和类脂A，如下图所示：

内毒素特性

• 性质稳定：160℃的温度下加热2-4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加热煮沸30分钟才能破坏它的生物活性。
• 经甲醛溶液处理后，可降低其毒性，但不能成为类毒素。

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  中国药典（CP）规定，药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：

  L=K/M

   

  式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；

  K为人每公斤体重每小时zui大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg• h)表示，注射剂K=5 EU/(kg• h)，放射性药品注射剂K=2.5 EU/(kg• h)，鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kg• h)；

  M为人用每公斤体重每小时zui大剂量，以ml (kg• h)、mg(kg• h)或U/(kg• h)表示，人均体重按60 kg计算，人体表面积按1.62 m2计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。

  按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。

   

  美国药典（USP）规定，非经肠道药品的内毒素限值，以剂量定义，等于：K/M。

  除了鞘内给药以外的任何给药途径，K均为5 USP-EU/kg，鞘内给药时，K为0.2 USP-EU/kg，对于非鞘内给药放射性药品，内毒素限值的计算为175/V，V为以ml为单位的zui大推荐剂量，对于鞘内给药的放射性药品，其内毒素限值为14/V，对于按以每平方体表面积计算的给药剂量（通常是抗肿瘤药品），计算公式为K/M，其中K=5 EU/kg，M为(zui大剂量/m2/小时×1.80m2)/70kg。

  检测方法的建立：

  1968年，由Leivin和Bang发现并建立了利用鲎试剂检测细菌内毒素的方法。他们发现，当遇到内毒素时，鲎的血液能够凝结成块。用鲎血液中的变形细胞提取物与待检样品混合，如果待检样品中含有内毒素，则会观察到上述情况。鲎试验法（LT）已经替代了热原检查家兔法检验药品中的内毒素。

  目前FDA已经批准了以下LAL检测法：凝胶法（ToxinSensorTM凝胶法内毒素检测试剂盒）、浊度法和显色法（ToxinSensorTM显色法LAL内毒素检测试剂盒）。

   

  LAL检测方法原理图

   

  

   

  半定量测定——凝胶法

  通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来半定量内毒素的方法，是各国药典细菌内毒素检查的方法。

  定量测定——浊度法和显色法

  浊度法（动态浊度法和终点浊度法）是通过鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化来测定内毒素含量的方法。终点浊度法是基于细菌内毒素浓度和反应混合物的终点浊度( 吸收度或透光率) 之间的定量关系的一种检测方法；动态浊度法（又称动态比浊法）是检测反应混合物的浊度上升某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

  显色法（动态显色法和终点显色法）是将鲎试剂与内毒素反应，可使特定底物显色，通过释放出的呈色团的多少来测定内毒素含量，又称为比色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间, 或检测色度增长速度的方法。

   

  内毒素检测方法的选择：

  凝胶法——仅需检测样品的内毒素*。此法操作比较简单、经济，不需要测定设备，可进行定性或半定量测定。

  显色法（或浊度法）——定量测定样品中内毒素含量。

• 日常检测量不大时，可以选择终点显色法，用普通的分光光度计就可完成实验。
• 检测的样品是生物制品、疫苗、血液制品等选用终点显色法或动态显色法。
• 检测量比较大，检测的样品对鲎试剂的干扰不大，可选用动态浊度法鲎试剂。

• 注：动态浊度法与动态显色法需要带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件。