技术文章

近年发展的时间分辨荧光测量技术以稀土离子为示踪材料，具有测量灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、定量分析量程宽、无放射性污染和应用范围广等优点。我们采用时间分辨荧光测量技术，建立了AFP时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）。

　　一、材料与方法

　　1. 材料与试剂：抗AFP单克隆抗体A₁₃₇和A₄₇由无锡市第二制药厂提供。Eu³⁺标记盒、Eu³⁺发光增强液、AFP TRFIA药盒和AFP参考标准，EG－G-Wallac产品。CA₁₉₉、CA₁₂₅和CA₁₅₃参考标准，CIBACORNING产品。AFP质量控制血清（L：21～35μg/L；M：62～93μg/L；H：173.4～260.2μg/L），中国药品生物制品鉴定所产品。全自动TRFIA检测仪（Auto DELFIA 1235）为EG－G-Wallac产品。

　　2. 固相抗体制备：将A₄₇单抗用50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃

　　pH9.6缓冲液稀释至10mg/L的包被液,微孔板各孔加200μl，4℃放置过夜。BSA封闭后真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

　　3. Eu³⁺-A₁₃₇制备：参照Eu³⁺标记盒说明书操作。取溶解于0.155mol/L

　　NaCl的50mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃ pH8.5缓冲液A₁₃₇（2g/L）500μl加入含0.2mg的Eu³⁺-N₂-［p-异氰酸-苄基］-二乙烯三胺四乙酸（Eu³⁺-DTTA）冻干粉的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20h。反应液经用80mmol/L

　　Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱（1cm×40cm）层析，A280监测收集蛋白峰。

　　4. 测定方法：采用平衡法建立AFP-TRFIA，即在包被有A₄₇的96孔微孔板上，每孔依次加入25μl AFP参考标准或待测血清，200μl以反应缓冲液1:1000稀释的Eu³⁺-A₁₃₇，25℃振荡孵育1h后，用洗涤液洗涤6次。再加增强液200μl，25℃振荡反应5min，荧光检测。全部过程均在Auto

　　DELFIA 1235上自动完成，软件设置由本所自编。

　　5. 数据分析和统计处理：AFP-TRFIA标准曲线由Auto DEFIA 1235自带的Log-Logit函数处理。精密度图和可测范围分析用吴德福IRMA数据处理软件。统计学处理用t 检验。

　　二、结果

　　1.Eu³⁺-A₁₃₇的理化和免疫学鉴定：Eu³⁺-A₁₃₇以EG－G-Wallac提供的Eu³⁺标准为参考，平均每个A₁₃₇ IgG上连接了7.52个Eu³⁺，产率达53.07%。选择AFP参考标准高点（1000μg/L），Eu³⁺-A₁₃₇ 1:1000稀释，进行TRFIA，Bmax/T为6.65%，与低点（1μg/L）的发光计数差达2个数量级以上。被测物和反应发光计数基本成算术级数正比关系。

　　2.AFP-TRFIA的考核：经Log-Logit函数处理程序处理得AFP-TRFIA标准曲线。（1）方法的特异性：将CEA、CA₁₉₉、CA₁₂₅和CA₁₅₃分别配成10～500U/ml、15.8～409U/ml、12.1～732U/ml和27.7～243U/ml一系列不同浓度，代替标准曲线中的AFP参考标准。在上述浓度范围内，CEA、CA₁₉₉、CA₁₂₅和CA₁₅₃对AFP-TRFIA均无交叉反应。（2）精密度和回收率：本方法的批内和批间CV分别为1.59%和7.14%，8批标准曲线的ABCV均小于0.0114，精密度图显示可测范围为4.22～1210μg/L，回收率为103.98%。（3）灵敏度和稳定性：以零剂量点发光值均值加2s后的发光值在标准曲线上得到的相应值为0.43μg/L。8条不同时间进行的AFP-TRFIA的效点均值ED₂₀、ED₅₀和ED₈₀分别为（4.25±0.21）μg/L、（35.59±0.19）μg/L和（246.90±0.96）μg/L。

　　三、讨论

　　TRFIA测量仪已进入第三代，分析技术已实现高度自动化。我们所建方法适于测量血清AFP的含量，Eu³⁺-A₁₃₇经标准曲线比较鉴定，免疫反应性基本无损失；其冻干品-30℃保存13个月后免疫反应参数基本未改变。用国家的AFP质控血清作样品进行分析，L、M和H分别为28.0μg/L、77.5μg/L和216.8μg/L，符合质控要求。我们曾把高含量的AFP血清样品经1:10～1000稀释后用于本方法的测定，换算后的AFP含量非常接近；用该系列稀释血清代替AFP参考标准作标准曲线，其斜率与AFP的标准曲线斜率基本一致，表明AFP-TRFIA有良好的健全性，血清基质对本方法没有明显影响。8孔重复4组参考标准点的ABCV均＜0.06，批内及批间重复性研究亦证明本方法是可靠的。以往超微量免疫分析技术每次分析，即使单样品检测也必须做标准曲线作相对测量的依据。我们建立的AFP-TRFIA同批试剂连续5个月应用分析，发现标准曲线基本重合，无明显漂移，可以用同批试剂单次标准曲线为今后分析的固定参考。这既可减轻临床应用的工作强度，又可提高药盒的经济价值。

　　AFP-TRFIA受检血清用量仅为RIA或IRMA的四分之一，有利于减少样品对分析系统的干扰，也有助于节约样品，便于多指标分析。AFP-TRFIA的分析时间仅为1h，且分析系统高度自动化，这样可提高临床检验结果的速度，又可大幅度降低人为误差和增加检出结果的可靠性。