固定及常用的固定液
• 取材后的组织需立刻投于固定剂中
– 固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；
– 对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。
• 常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。
– 醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）
– 醇类（常用乙醇）
– 其它 （丙酮）
(1) 醛类
• 甲醛(福尔马林)应用zui广
– 原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。
– 优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。
– 缺点：
• 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；
• 醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；
• 分子间交联形成的网格结构可能部分或*掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
– 注意事项：
• 缩短固定时间，降低固定温度(4?C)，为此组织块不宜过厚。
• 改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。
• 固定后充分水洗以减少分子间交联。
• 切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。
• 戊二醛：
– 穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。
• 多聚甲醛(常用4%)：
– 可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。
• 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。
(2) 醇类
• zui常用的醇类固定剂是乙醇。
– 其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。
– 优点：穿透性强、抗原性保存好。
– 缺点：
• 脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。
• 乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。
(3) 其它固定剂
• 丙酮：
– 对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。
抗原修复——原因
• 常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得：
– 抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇；
– 蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
• 要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态
