明胶酶谱法原理:
酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺 (SDS-PAGE,含0.1%明胶)电泳分离,然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2(基质金属蛋白酶-2)和MMP-9恢复活性,在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶,zui后用考马斯亮蓝将凝胶染色,再脱色,在蓝色背景下可出现白色条带,条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理:在电泳过程中,SDS与样品中的MMPs结合(当然是可逆性结合),破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用,而只有当将胶置Trition中洗脱(是放在摇床上摇,30min/次,做2次或15min/次,4次。静置于Trition中是不妥的)时,由于SDS被Trition结合而去除,从而使MMPs恢复了活性。
1、制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。
2、明胶酶谱的活性受钙离子,锌离子,和PH值等因素的影响,因此缓冲液配制应严格准确,尽量用超纯水,孵育温度也掌握好。
3、用大梳子。
4、孵育液的PH在7.5-7.6,复性的TRITON时间长了会有絮状物,所以实验时尽量使用新鲜配置的。
5、孵育的37度不要在CO2培养箱中,因为会改变孵育液的PH值,在普通孵箱即可。
6、明胶要4度保存,配好后1周内使用。