技术文章

一、概况及发展历史

1．原理
在吸收紫外和可见电磁辐射的过程中，分子受激跃迁至激发电子态，大多数分子将通过与其它分子的碰撞以热的方式散发掉这部分能量，部分分子以光的形式放射出这部分能量，放射光的波长不同于所吸收辐射的波长。

后一种过程称作光致发光。分子发光包括荧光、磷光、化学发光、生物发光和散射光谱等。基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光谱法。

由光源发出的光通过切光器使其变成断续之光，通过激发光单色器变成单色光，此光即为荧光物质的激发光。被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照射于光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放大输至记录仪。一个激发，一个发射，采用双单色器系统，可分别测量激发光谱和荧光光谱。

2．分类
荧光光谱仪是测定材料发光性能的基本设备。 通用荧光光谱仪大致可分为3种：
(1) 基本型：在200-800 nm的紫外可见波段的稳态光谱仪。 
(2) 扩展型：覆盖200-1700 nm波段的紫外可见-近红外稳态光谱仪。 
(3) 综合型：覆盖上述两个波段，同时可测瞬态光谱的光谱仪。

3．主要用途
（1）荧光激发光谱和荧光发射光谱； 
（2）同步荧光（波长和能量）扫描光谱；
（3）3D（Ex Em Intensity) ；
（4）Time Base和CWA(固定波长单点测量）； 
（5）荧光寿命测量，包括寿命分辨及时间分辨；
（6）计算机采集光谱数据和处理数据（Datamax和Gram32)。

4．发展历史
*次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。在17世纪，Boyle（1626—1691）和Newton（1624—1727）等科学家再次观察到荧光现象。之后荧光就引起了许多科学家的研究兴趣，荧光分析方法也越来越多的被应用到生物和化学分析当中。

当然荧光分析方法的发展，与仪器应用的发展是分不开的。总体来说，荧光光谱仪自问世以来经过了三个阶段的发展过程：
（1）手动式；
（2）自动扫描；
（3）微机化。

19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了*台光电荧光计。光电荧光计的灵敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman发明光电倍增管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。1943年Dutton和Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤，1948年由Studer推出了*台自动光谱校正装置，到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。 

二、主要部件及功能

荧光光谱仪主要包括光源、激发单色器、样品池、荧光单色器及检测器等主要部件。

1．光源
早期的荧光分光光度计，配有能发生很窄汞线的低压汞灯。使用高压汞灯，谱线被加宽，而且也存在高强度的连续带。然而，一个完整的激发光谱的测定需一种能发射从可见到紫外范围的较高强度的光辐射的灯。氙弧灯能适于此条件，因此，它是目前在荧光分光光度计中zui广泛使用的光源。

2．单色器
单色器的作用是把光源发出的连续光谱分解成单色光，并能准确方便地“取出”所需要的某一波长的光，它是光谱仪的心脏部分。单色器主要由狭缝、色散元件和透镜系统组成，其中色散元件是关键部件。色散元件是棱镜和反射光栅或两者的组合，它能将连续光谱色散成为单色光。

（1）棱镜单色器
棱镜单色器是利用不同波长的光在棱镜内折射率不同将复合光色散为单色光的。棱镜色散作用的大小与棱镜制作材料及几何形状有关。常用的棱镜用玻璃或石英制成。可见分光光度计可以采用玻，它适用于紫外、可见整个光谱区。

（2）光栅单色器
光栅作为色散元件具有不少*的优点。光栅可定义为一系列等宽、等距离的平行狭缝。光栅的色散原理是以光的衍射现象和干涉现象为基础的。常用的光栅单色器为反射光栅单色器，它又分为平面反射光栅和凹面反射光栅两种，其中zui常用的是平面反射光栅。光栅单色器的分辨率比棱镜单色器分辨率高（可达±0.2nm），而且它可用的波长范围也比棱镜单色器宽，且入射光80%的能量在一级光谱中。近年来，光栅的刻制复制技术也在不断地改进，其质量也在不断的提高，因而其应用日益广泛。

（3）狭缝
狭缝是单色器的重要组成部分，直接影响到分辨率。狭缝宽度越小，单色性越好，但光强度也随之减少。

3．样品池
荧光仪用的样品池需用低荧光的材料制成，通常用玻璃和石英材料，形状以方形和长方形为宜。

4．检测器
主要有硒光电池、光电管和光电倍增管等。目前来说由于荧光的强度较弱，一般以光电倍增管作检测器。选择光电倍增管要考虑响应波长、灵敏度和噪声水平等。蓝敏管对蛋白质、核酸的测量适用，而红敏管则适用于荧光染料检测。

三、应用

目前荧光分析法已经发展成为一种重要且有效的光谱化学分析手段。在我国，50年代初期仅有极少数的分析化学工作者从事荧光分析方面的研究工作，但到了70年代后期，荧光分析法已引起国内分析界的广泛重视，在全国众多的分析化学工作者中，已逐步形成一支从事这一领域工作的队伍。

1. 荧光分析特点
（1）荧光分析的主要特点是灵敏度高、选择性好，荧光分析的灵敏度要比吸收光谱测量高2-3个数量级。分光光度法通常在 10-7 级 ，而荧光的灵敏度达10-9。

（2）强选择性强，荧光物质具有两种特征光谱：激发光谱和吸收光谱，相对于分光光度法单一的吸收光谱来说，荧光光谱可根据激发光谱和发射光谱来鉴定物质。 

（3）信息量丰富，能提供荧光物质的多种参数。 

（4）但是荧光分析方法也有其不足之处：①很多物质本身不发荧光；②荧光的产生与化合物结构的关系不明确；③干扰因素多，光分解、氧淬灭、易污染。 

2. 主要应用
（1）在生物领域的应用

该领域主要用于临床测定生物样品中某些成分的含量，生物技术及免疫技术的分析等，如脱氧核糖和脱氧核糖核酸的含量测定、DNA、抗体、抗原等各方面的研究。在此领域中主要时利用各种荧光探针进行分析检测，主要分为生物纳米荧光探针和生物非纳米荧光探针。

其中纳米技术的兴起，打开了荧光分析的又一个新的领域。由于纳米材料具有很好的荧光性，宽激发，窄发射等优良的光谱特点，使其成为荧光分析中的重要的研究对象，引起了研究者的兴趣。

（2）在食品领域的应用

该领域主要用于食品中矿物质及金属元素、氨基酸、维生素、菌类污染、添加剂、防腐剂、食品包装有害物质、农药残留等的分析检测。特别是与HPLC、TLC、FIA等技术的结合可以更好的达到食品中各种物质的检测效果。

目前我国食品标准日趋化，对于食品分析的要求也越来越趋向于灵敏和微量化。荧光分析正可以满足这方面的分析要求。

（3）在药物分析中的应用

药物分析领域可以利用荧光分析进行药物的有效成分鉴定、药物代谢动力学研究、临床药理药效分析等。

药物荧光分析可以分为三类：直接荧光分析、间接荧光分析和纳米荧光分析。
常规荧光分析法zui早被应用于分析抗疟疾药物奎宁，随着荧光分析法的发展，其应用范围日益扩大，目前被广泛用于抗菌素药物、止痛药、镇静剂、止血药等的分析。

（4）在环境分析中的应用

该领域主要利用荧光分析检测环境中的物质的含量，主要是对水体、矿石和土壤进行检测。随着有机化工、石油化工、医药工业的发展, 以及农药( 杀虫剂、除草剂等) 的大量使用, 有机化合物对环境的危害和污染日益严重。

目前被列入有机污染物监测国家标准方法中的荧光分析法有；冷原子荧光法对有机汞的测定；乙酰化滤纸层析荧光分光光度法对大气飘尘和水体中苯并( a) 芘的测定；酚类 、木质磺酸酯、多环芳烃( 芘、萤、蒽) [ PASH]的荧光分析法测定等。

四、仪器发展方向

近年来，发展了各种新型荧光分析技术，如激光诱导荧光法、同步荧光法、导数荧光法、荧光探针法、光化学荧光法、时间分辨荧光法、三维荧光法、偏振荧光法、荧光免疫测定法、荧光成像技术、荧光光纤传感器等。

这些技术的应用加速了各种新型荧光分析仪器的研制，使荧光分析不断朝着、痕量、微观和自动化方向发展。

随着科技的发展，激光，微机，电子学等新技术的引进，使荧光光谱仪在理论及实际应用上都得到了快速的发展，主要发展方向如下：

（1）分辨率提高；
（2）扫描速度加快；
（3）多功能，可同机进行荧光、磷光和化学发光测量；利用光纤传感的平板扫描仪附件还可进行薄层色谱分离斑点的扫描测定等；

（4）促使应用技术的扩展：
①时间分辨(相分辨)
②荧光偏振(荧光免疫)
③同步荧光
④三维荧光
⑤荧光光纤化学传感器等分析新方法相继出现，10-6S级荧光寿命的测定。

（5）紧凑型，便捷型。